【摘 要】
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真核细胞内生命活动的高效运行依赖于复杂的细胞器互作网络。内质网（ER）与细胞质膜（PM）关系紧密,形成距离不足30 nm的ER-PM结合位点,为内质网与质膜间的物质运输及信号交流提供了平台。当逆境胁迫导致蛋白质的折叠过程受损时,将会引发内质网胁迫,细胞会启动未折叠蛋白反应来抵御内质网胁迫。在酵母及动物细胞中,皮层内质网及ER-PM结合位点参与了细胞对内质网胁迫的响应,但在植物中还未见相关报道。本研
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真核细胞内生命活动的高效运行依赖于复杂的细胞器互作网络。内质网（ER）与细胞质膜（PM）关系紧密,形成距离不足30 nm的ER-PM结合位点,为内质网与质膜间的物质运输及信号交流提供了平台。当逆境胁迫导致蛋白质的折叠过程受损时,将会引发内质网胁迫,细胞会启动未折叠蛋白反应来抵御内质网胁迫。在酵母及动物细胞中,皮层内质网及ER-PM结合位点参与了细胞对内质网胁迫的响应,但在植物中还未见相关报道。本研究通过细胞生物学、遗传学、分子与生物化学等研究手段,开展对拟南芥ER-PM连接蛋白VAP27-1在内质网胁迫中的功能及其调控机制的研究。主要结果如下:（1）激光共聚焦显微镜观察显示,VAP27-1-EGFP广泛分布于拟南芥幼苗的各个组织。其亚细胞定位主要集中于细胞质膜,且在质膜上呈不均一网状分布,在特异性位点富集。（2）通过可变角度全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）对质膜上VAP27-1-EGFP进行单分子成像,实时追踪荧光点的运动轨迹,并结合运动速度和扩散系数等动力学参数分析发现,VAP27-1-EGFP在质膜上具有高度时空稳定性。（3）本研究利用CRISPR/Cas9技术获得vap27-1 vap27-3 vap27-4三突变体,并发现Cas9对不同靶点的基因编辑效率不同,对同一靶点的基因编辑也能产生多种突变类型。通过测序检测发现,CRISPR/Cas9介导的纯合突变会稳定遗传,且具有极低脱靶风险。（4）通过观察和分析正常生长及内质网胁迫条件下vap27-1 vap27-3 vap27-4三突变体与野生型（WT）拟南芥的生长状态发现,vap27-1 vap27-3 vap27-4在内质网胁迫时比WT根长更短,且根尖细胞死亡程度更高。而在vap27-1 vap27-3 vap27-4中回补VAP27-1-EGFP,可在一定程度上缓解内质网胁迫引起的根长变短的表型。（5）实时荧光定量PCR（q RT-PCR）及蛋白免疫印迹实验结果表明,内质网胁迫时,VAP27-1基因的转录水平略有提高,而VAP27-1-EGFP在蛋白水平的表达量未发生显著变化。VA-TIRFM观察发现,内质网胁迫时VAP27-1-EGFP在质膜上的运动速度减慢,扩散系数减小,运动状态更加稳定,其在膜上的分布规律也发生变化,形成较多的池状结构。（6）转录组测序技术及q RT-PCR实验发现,在正常生长条件下,vap27-1 vap27-3vap27-4幼苗比WT具有更高的组成型未折叠蛋白反应信号;当内质网胁迫时,vap27-1vap27-3 vap27-4中未折叠蛋白反应相关基因的表达量也高于WT。（7）运用高压冷冻固定及透射电镜联合技术观察vap27-1 vap27-3 vap27-4与WT根尖细胞的超微结构发现,不论在正常生长条件还是内质网胁迫条件下,与WT相比,vap27-1 vap27-3 vap27-4细胞内内质网的膜面积均较小,且内质网与质膜联系较弱。（8）蓝绿温和胶实验显示,VAP27-1与介导未折叠蛋白反应途径的AGB1存在共复合体的情况。随后观察vap27-1 vap27-3 vap27-4 agb1四突变体在内质网胁迫时的生长状态发现,与vap27-1 vap27-3 vap27-4及agb1幼苗相比,vap27-1 vap27-3 vap27-4agb1对内质网胁迫更敏感。本研究深化了植物内质网胁迫及未折叠蛋白反应信号途径的分子及细胞学机制,同时也为提高植物广谱性抗逆提供了新思路,具有一定的应用价值。
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