肝癌是我国常见的恶性肿瘤,目前五年生存率仅为12%左右。肝癌的主要致死原因是肿瘤的远处转移,该过程是一个多步骤、多阶段的过程,涉及众多信号通路的传导异常和效应分子的异常表达。因此,深入探究肝癌转移过程中的关键驱动基因,明确其作用机制,并以此为基础寻找预防和治疗肝癌转移的新靶点,具有重要的科学研究价值和临床意义。Hippo通路的激酶级联主要是通过调控其下游的终末效应组分YAP（yes-associated protein）/TAZ（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif）的转录共活化作用,抑制肿瘤进展。研究表明,MOB基因家族作为Hippo通路的重要组分,其成员MOB2可以与MOB1竞争结合NDR1/2的N端调控结构域（但不能与LATS1/2激酶结合）,抑制NDR1/2激酶活性,调控细胞周期和细胞凋亡等过程。NDR1/2可以促进YAP的S127位点磷酸化,抑制YAP的转录激活作用。这些研究结果提示MOB2可能也参与了 Hippo肿瘤抑制信号通路的调控。课题组前期研究发现,MOB2可以调控肝癌细胞的细胞周期进程以及细胞的迁移、侵袭和自噬过程,但具体作用机制尚未完全明确。近年来研究表明,中西医结合治疗可增强肿瘤患者的免疫力,提高化放疗疗效。“癌毒”理论的提出是中医学对肿瘤病机理论的新认识,为中医抗肿瘤的辨证论治提供了新思路。癌毒的流窜性是肿瘤顽固难治的主要原因,研发靶向癌毒流窜性的中药有效成分对于临床抗肝癌治疗具有重要的临床意义。清热解毒作为中医治疗肝癌的经典治法之一,在肝癌治疗中获得了较好的疗效。芹菜素（Apigenin）是一种具有清热解毒功效的黄酮类化合物,可通过调控多个靶点及信号通路发挥抗肿瘤作用;但芹菜素能否通过调控Hippo信号通路发挥抗肿瘤作用尚未见报道。基于课题组前期的研究结果及对现有文献资料的考证,本研究将采用慢病毒介导的RNA沉默表达等方法在不同迁移潜能的肝癌细胞中阐明MOB2通过Hippo信号通路调控肝癌细胞迁移和侵袭的作用方式及具体机制,并在肝癌组织水平和小鼠动物模型水平研究MOB2在肝癌转移中发挥的作用。同时,本研究还将探究芹菜素能否通过调控Hippo通路影响不同迁移能力肝癌细胞的迁移和侵袭,进一步揭示芹菜素抗肿瘤的分子机制,为中西医结合抗肿瘤治疗提供理论基础。具体内容包括以下三部分:第一章MOB2对肝癌细胞迁移、侵袭和细胞自噬的影响目的:明确MOB2参与肝癌发病及其对肝癌细胞迁移、侵袭及细胞自噬的影响。方法:为了研究MOB2的表达与肝癌生长和转移的相关性,首先,我们通过TCGA数据库分析了肝癌患者的癌组织和癌旁组织中MOB2的表达差异及其与肿瘤预后的相关性;其次,采用RT-qPCR和Western Blot方法检测了临床确诊肝癌患者的癌组织和对应癌旁组织标本中MOB2的mRNA水平及蛋白水平;最后,利用MOB2稳定干扰表达和对照组的肝癌细胞SK-HEP1建立裸鼠皮下移植瘤模型和体内实验性转移小鼠模型,研究MOB2干扰表达对小鼠体内移植瘤生长及体内转移的影响。在明确MOB2参与肝癌发病的基础上,我们研究MOB2对肝癌细胞迁移、侵袭以及细胞自噬的影响。首先,采用Transwell实验、3D Matrigel细胞侵袭实验和免疫荧光染色细胞中LC3B,研究MOB2干扰表达对不同迁移能力的肝癌细胞迁移、侵袭和细胞自噬的影响。其次,采用RT-qPCR和Western Blot实验检测了 MOB2干扰表达对不同迁移能力的肝癌细胞中调控上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）关键基因和自噬相关基因表达的影响。再次,采用罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞中F-actin,研究了 MOB2对不同迁移能力的肝癌细胞中肌动蛋白细胞骨架纤维装配的影响;同时,采用Rho GTP酶活性检测实验检测了 MOB2干扰表达对不同迁移能力的肝癌细胞中RhoA、Rac1和Cdc42活性的影响。最后,在MOB2干扰表达的细胞中添加细胞自噬早期抑制剂3-Methyladenine（3MA）和晚期抑制剂氯喹（CQ）,研究MOB2能否通过调控细胞自噬影响肝癌细胞的迁移。结果:TCGA数据库分析结果显示,MOB2在肝癌组织中的表达高于癌旁组织,其表达与肝癌复发呈显著正相关;RT-qPCR和Western Blot实验结果显示,MOB2在肝癌组织样本中表达高于对应癌旁组织;裸鼠皮下移植瘤模型和体内实验性转移小鼠模型结果显示,MOB2干扰表达可以抑制小鼠体内移植瘤的生长及体内的肝和肺转移。Transwell实验结果表明,MOB2干扰表达可以显著抑制不同迁移能力肝癌细胞的迁移与侵袭,该结果与课题组前期研究结果相一致;3D Matrigel细胞侵袭实验进一步证实了 MOB2干扰表达可以显著抑制SMMC-7721细胞的成球侵袭和细胞集团迁移、侵袭能力;免疫荧光实验结果显示,MOB2干扰表达可以促进自噬斑的形成,促进细胞自噬。基于前期对MOB2干扰表达的肝癌细胞RNA-seq分析结果,我们采用RT-qPCR和Western Blot进行了验证。RT-qPCR实验结果显示,与对照组相比,MOB2干扰表达显著上调SMMC-7721和SK-HEP1细胞中E-cadherin和Snail、下调N-cadherin。Western Blot实验结果显示,MOB2干扰表达可以显著上调SMMC-7721和SK-HEP1细胞中E-cadherin、下调N-cadherin,但对Snail和Vimentin无显著影响。免疫荧光结果显示,MOB2干扰表达的细胞与细胞之间排列相对紧密,细胞周缘F-actin丰富,细胞前缘的片状伪足和丝状伪足显著减少。Rho GTP酶活性检测实验结果显示,与对照组相比,MOB2干扰表达可以下调细胞中Rac1和Cdc42活性,上调RhoA活性。我们在MOB2干扰表达的细胞中添加细胞自噬抑制剂3MA和CQ,通过Transwell细胞迁移实验证实,抑制细胞自噬可部分逆转MOB2干扰表达对细胞迁移的抑制作用,尤其以添加晚期抑制剂CQ组更显著。结论:MOB2在肝癌中高表达,并与肝癌的发生、发展和转移密切相关。MOB2干扰表达可通过调控肝癌细胞中Rho GTP酶的活性,影响细胞中肌动蛋白细胞骨架纤维的重排,进而调控肝癌细胞的迁移和侵袭;MOB2干扰表达可调控肝癌细胞中EMT关键基因和自噬相关基因的表达,并通过促进细胞自噬抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。第二章MOB2通过Hippo通路调控肝癌细胞的迁移、侵袭和细胞自噬的机制研究目的:明确MOB2通过调控Hippo通路影响肝癌细胞的迁移、侵袭和细胞自噬的具体机制。方法:首先,应用荧光素酶报告基因实验检测了 MOB2干扰表达的不同迁移能力肝癌细胞中含CTGF和CYR61启动子的荧光素酶报告基因的表达情况;其次,分别使用抗YAP抗体和抗TAZ抗体进行ChIP实验,采用ChIP-qPCR方法检测了 MOB2干扰表达的肝癌细胞中CTGF和CYR61启动子序列片段的富集情况。最后,采用Western Blot和免疫共沉淀检测了 MOB2沉默表达对肝癌细胞中Hippo信号通路相关基因表达和活性的影响。在明确了 MOB2可调控YAP/TAZ转录激活活性的前提下,我们研究了 YAP/TAZ对肝癌细胞迁移、侵袭和细胞自噬的影响。首先,我们成功建立了 YAP干扰表达和TAZ干扰表达的SMMC-7721细胞,提取各组细胞中的总RNA进行RNA-seq检测,并通过RT-qPCR以及Western Blot实验验证,明确YAP干扰表达和TAZ干扰表达对肝癌细胞中EMT关键基因和自噬相关基因表达的影响。其次,采用Transwell实验和细胞自噬流实验分别研究了 YAP干扰表达、TAZ干扰表达和敲除TAZ对不同迁移能力的肝癌细胞迁移、侵袭和细胞自噬的影响。再次,我们通过添加细胞自噬抑制剂,研究了 YAP干扰表达、TAZ干扰表达和敲除TAZ是否通过调控细胞自噬而影响肝癌细胞迁移和侵袭。最后,采用RNA dot blot、Western Blot和Me-RIP-qPCR实验,初步研究MOB2、YAP和TAZ干扰表达的肝癌细胞中RNA m6A修饰水平、RNA m6A调节蛋白的表达水平以及MOB2干扰表达的细胞中Snail的mRNA被抗m6A抗体富集情况。结果:荧光素酶报告基因检测结果显示,MOB2干扰表达可下调细胞中含CTGF和CYR61启动子的荧光素酶报告基因的表达;ChIP-qPCR检测结果显示MOB2干扰表达的细胞中被抗YAP抗体和抗TAZ抗体富集的CTGF和CYR61启动子序列片段显著减少。这些结果提示,MOB2可以通过调节肝癌细胞中YAP/TAZ的转录活性,调控其下游靶基因CTGF和CYR61的表达。Western Blot检测结果显示,与对照组相比,MOB2干扰表达可以显著促进MOB1、LATS1、YAP以及TAZ的磷酸化;免疫共沉淀结合Western Blot检测结果显示,MOB2能够与NDR1/2结合,但不能与LATS1/2结合;在MOB2沉默表达的细胞中,MOB1在NDR1/2免疫沉淀物中被富集,而在LATS1免疫沉淀物中减少。此外,Western Blot检测结果还显示,MOB2沉默表达可以上调细胞中NDR1/2的Thr444/442位点磷酸化（pT444/442）。RNA-seq检测差异基因表达分析结合RT-qPCR和Western Blot实验结果显示,与各自对照组相比,YAP干扰表达和TAZ干扰表达均可以下调肝癌细胞中N-cadherin、Vimentin和 SQSTM1/p62,上调 E-cadherin、β-catenin、LC3BⅡ和 ULK1;Transwell 细胞迁移和侵袭实验结果表明,YAP干扰表达、TAZ干扰表达和敲除TAZ均可以抑制肝癌细胞迁移和侵袭。细胞自噬流实验结果也表明YAP干扰表达、TAZ干扰表达和敲除TAZ均可以促进细胞中自噬流的形成。此外,我们分别采用细胞自噬抑制剂3MA和CQ处理YAP干扰表达、TAZ干扰表达和敲除TAZ的肝癌细胞,Transwell实验结果显示,3MA和CQ可以部分逆转YAP干扰表达、TAZ干扰表达和敲除TAZ对肝癌细胞的迁移和侵袭的抑制作用;同时,Western Blot实验检测结果显示,抑制细胞自噬可以上调YAP干扰表达、TAZ干扰表达和敲除TAZ的细胞中N-cadherin、Vimentin、LC3BⅡ和 SQSTM1/p62,下调 E-cadherin,尤以添加 CQ 更加显著。RNA dot blot检测结果显示,MOB2、YAP和TAZ干扰表达均可以降低细胞中总RNA m6A修饰水平;Western Blot检测结果显示,MOB2干扰表达、YAP干扰表达和TAZ干扰表达可以上调FTO、ALKBH5、YTHDC1和YTHDF3,下调WTAP;而YAP干扰表达还可以上调IGF2BP2。Me-RIP-qPCR实验结果显示,MOB2干扰表达的SMMC-7721和SK-HEP1细胞中抗m6A抗体富集的Snail mRNA较对照组显著增多。结论:MOB2干扰表达一方面可促进MOB1与NDR1/2结合,激活NDR1/2激酶活性,促进YAP磷酸化,激活Hippo信号通路;另一方面,MOB2干扰表达可通过激活肝癌细胞中的Hippo信号通路,抑制YAP/TAZ的转录激活活性,调控EMT关键基因和自噬相关基因等的表达,通过促进细胞自噬抑制细胞的迁移和侵袭。YAP或TAZ沉默表达可以通过促进细胞自噬抑制EMT进程,进而抑制细胞的迁移和侵袭。此外,MOB2、YAP/TAZ还可能通过调控肝癌细胞的mRNA m6A修饰水平影响EMT关键基因的表达。第三章芹菜素通过下调YAP影响肝癌细胞迁移、侵袭和细胞自噬的研究目的:明确芹菜素调控肝癌细胞迁移、侵袭和细胞自噬的作用机制。方法:首先,采用CCK-8试剂盒、细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测了芹菜素对低迁移能力的SMMC-7721细胞和高迁移能力的SK-HEP1细胞的细胞活力、迁移和侵袭的影响;并使用罗丹明标记的鬼笔环肽染色SMMC-7721和SK-HEP1细胞中肌动蛋白细胞骨架纤维,检测芹菜素对细胞中肌动蛋白细胞骨架纤维装配的影响。其次,采用RNA-seq检测芹菜素处理的肝癌细胞SMMC-7721中的差异基因表达谱,通过KEGG对差异表达的基因进行了通路富集分析;并通过RT-qPCR和Western Blot实验验证了芹菜素处理后的肝癌细胞中一些差异基因表达的变化。再次,我们综合分析了芹菜素处理组的RNA-seq分析结果和YAP干扰表达组RNA-seq分析结果,明确两组内重叠的差异表达基因;采用RT-qPCR和Western Blot实验验证芹菜素对SMMC-7721和SK-HEP1细胞中一些EMT关键基因和自噬相关基因表达的影响;并应用细胞自噬流实验检测了芹菜素对两种肝癌细胞自噬的影响。最后,采用腺病毒感染的方法构建YAP过表达的SMMC-7721和SK-HEP1细胞模型,通过Transwell实验、RT-qPCR和Western Blot实验研究了芹菜素是否通过调控YAP表达来抑制细胞迁移和侵袭以及促进细胞自噬。结果:CCK-8实验检测结果显示,芹菜素可以以剂量依赖的方式抑制不同迁移能力的肝癌细胞的细胞活力。细胞划痕实验、Transwell实验和免疫荧光实验检测结果显示,芹菜素可以抑制肝癌细胞迁移和侵袭,影响细胞中肌动蛋白细胞骨架纤维的重排。RNA-seq检测结果显示,芹菜素处理后的肝癌细胞中差异表达基因中有713个上调、956个下调;KEGG分析显示,这些差异表达基因涉及Hippo信号通路;RT-qPCR和Western Blot验证结果显示,芹菜素可以下调细胞中CTGF、CYR61和YAP,但对TAZ表达无显著影响。芹菜素处理组的RNA-seq分析结果和YAP干扰表达组的RNA-seq分析结果中重叠的差异表达基因有785个,其中包含YAP、CTGF、CYR61和一些EMT标记基因以及自噬相关基因。RT-qPCR或Western Blot验证结果显示,芹菜素可以上调细胞中E-cadherin、β-catenin、ULK1和LC3BⅡ,下调细胞中CTGF、CYR61、YAP、N-Cadherin、Vimentin 和 SQSTM1/p62,同时,细胞自噬流实验结果显示,芹菜素可增加肝癌细胞中自噬流的形成。进一步研究发现,芹菜素可部分逆转YAP过表达对SMMC-7721和SK-HEP1细胞的迁移和侵袭能力以及对细胞中EMT关键基因和自噬相关基因表达的影响,并可以协同抑制YAP稳定干扰表达的SMMC-7721细胞的迁移和侵袭。结论:芹菜素可通过下调Hippo通路的下游效应分子YAP,调控EMT关键基因和自噬相关基因的表达,影响肝癌细胞的迁移、侵袭和细胞自噬。