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核酸是生物体重要的组成成分之一,可分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。MicroRNA(miRNA)是RNA的一种,它广泛存在于病毒、动物和植物的细胞中。miRNA在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、脂肪代谢等生命活动中发挥着重要的调控作用。miRNA突变或异位表达与多种人类疾病有关。目前存在的多种检测miRNA的方法,可是这些方法或者检测限低,或者成本高,或者步骤多,因此建立一种简单、成本低、灵敏度高的miRNA检测方法非常必要。端粒是线状染色体末端的DNA重复序列,是线状染色体末端的一种特殊结构,能保护染色体末端免于融合和退化,在染色体的定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要的作用。人的端粒是由重复的TTAGGG单元组成的,很容易形成G-四链体,G-四链体碎片可能在体液中存在,但目前尚没有检测端粒碎片的方法,所以建立一种简单、快速、灵敏度高的检测端粒碎片的方法非常必要。核酸适体是能够特异识别靶标的RNA、ssDNA或经修饰的核酸。经过二十多年的发展,核酸适体已被广泛应用到生物、化学、医学等多个研究领域。在本文中建立了检测miRNA的方法,检测端粒碎片的方法,以及用双功能核酸适体为模板合成了银纳米簇,并且用于构建分子逻辑门。
主要研究内容分为以下几个方面:
1.快速、灵敏的检测miRNA对miRNA本身的生物学研究及临床诊断有着重要的意义。在反转录-实时定量PCR技术的基础上,建立了一种灵敏度高、特异性好的miRNA检测方法。整个检测过程,包括反转录和定量PCR都在实时定量的PCR小管中一步完成。测定miRNA Let-7a的线性范围为0.1 amol到10fmol,检测限为12.6zmol。用此方法成功的从不同细胞中提取的小RNA中检测到了Let-7a。本方法不仅灵敏度高、特异性好、花费低,还可以实现高通量miRNA的分析。
2.快速、灵敏的检测端粒碎片对循环核酸的研究有着重要的意义。在本文中,在恒温扩增技术的基础上,建立了一种灵敏度高、特异性好检测端粒碎片的方法。用这个方法测定端粒碎片在细胞培养液中的线性范围为80pmol/L-900 pmol/L。用此方法成功地分析了不同的细胞培养基中端粒碎片,考察了阿霉素对MCF-7细胞和HeLa细胞培养液中端粒碎片浓度的影响。本方法灵敏度高、特异性好、花费低。
3.核酸适体是能够特异识别某一或某类靶标的RNA、ssDNA或经修饰的核酸。分别以双功能的核酸适体SA-ATP1,SA-ATP1-Y1,SA-ATP1-Y2,SA-ATP1-Y3,SA-ATP1-Y4为模板,用硼氢化钠还原法合成了银纳米簇,SA-ATP1-Y1,SA-ATP1-Y2,SA-ATP1-Y4银纳米簇具有红色的荧光。SA-ATP1-Y2银纳米簇荧光很强,与ATP和链霉亲和素的结合能力也很强,以其与靶分子的识别特性构建了分子逻辑门。