大豆疫霉(Phytophtora sojae)侵染大豆(Glycine max)引起的根腐病是全世界大豆生产的毁灭性病害之一。大豆疫霉在田间主要通过孢子囊释放的游动孢子侵染感病寄主。因此,研究并掌握大豆疫霉孢子囊和游动孢子形成发育及趋向和侵染寄主植物的分子调控机制是解释病害发生和开发病害防控,综合治理办法的根本途径。促有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)信号途径在真核生物中普遍存在且高度保守,其功能在微生物、动物、植物乃至人类中都已有研究报道。该信号途径在调控生命体的生长发育、分化、识别应答外界环境刺激及胁迫中都具有重要的作用,特别是在病原微生物中常常参与调控致病性。由于大豆疫霉基因组较大,结构复杂,且疫霉菌遗传转化技术难度较高不易掌握使得大豆疫霉基因功能研究进展迟缓。本文综合利用生物信息学,real time RT-PCR,基因沉默技术对大豆疫霉促有丝分裂原蛋白激酶家族进行了全基因组鉴定以及两个MAPK基因PsSKA1.PsMPK1的功能分析。大豆疫霉MAPK基因的预测和分析：大豆疫霉引起的大豆根腐病是大豆生产上危害最严重的病害之一,但在分子水平上研究大豆疫霉致病机理的进展仍然非常缓慢。本研究从信号传递关键分子MAPK(mitogen-actiVated protein kinase,促有丝分裂原蛋白激酶)入手,阐述大豆疫霉生长发育和致病的分子机制。MAPK信号传递途径在真核生物生长发育、应答外界环境变化等过程中起关键作用。应用生物信息学方法,我们从大豆疫霉全基因组中鉴定出14个MAPK的编码基因,这个数目远远高于真菌,而与绿色植物的数目相近。在这14个大豆疫霉MAPK编码基因中有10个MAPK的磷酸化位点为TEY,另外4个MAPK的磷酸化位点分别是SEY.TEH(两个)和TKH。通过系统发育和功能域分析,我们发现了以大豆疫霉为代表的卵菌所特有的四类新的MAPK基因,这在目前已知的MAPK蛋白结构中尚未报道。这14个MAPK基因在整个基因组中随机分布,且其基因结构呈现多样性。大豆疫霉MAPK基因的生物信息学分析为以后的研究奠定了基础。大豆疫霉MAPK基因的转录分析：在对大豆疫霉MAPK基因家族生物信息学分析的基础上,我们采用了荧光实时定量RT-PCR技术对其在大豆疫霉不同生长发育时期和侵染互作阶段的转录水平进行了研究。结果表明：在大豆疫霉14个MAPK中,只有一个基因(PsMPK9)在所有样品中均未检测到转录信号,其他的基因转录均表现出一定的规律。有9个基因在游动孢子阶段与菌丝阶段相比,转录存在明显差异,其中有6个基因(PsMPK2、3、7、10、11、13)上调,3个基因(PsMPK1、4、12)下调。休止孢萌发阶段有6个基因(PsMPK2、3、7、10、12、13)转录水平上调显著；亲和互作6h时有3个基因(PsMPK1、2、3)显著上调表达；在亲和互作24h时有3个基因(PsMPK1、2、3)显著上调表达。本研究结果表明,大豆疫霉MAPK可能广泛地参与了大豆疫霉生长发育和侵染过程,并且通过real time RT-PCR的分析可以帮助我们有针对性的选择基因来进行基因功能研究。PsSAKl (PsMPK3)参与调控大豆疫霉游动孢子发育和致病过程：在本章研究中,我们鉴定了一个大豆疫霉PsSAK1基因,该基因编码一个胁迫诱导的促有丝分裂原蛋白激酶,而且在已测序的卵菌中是高度保守的。PsSAKl蛋白具有PH结构域,是一类新的MAPK蛋白。半定量RT-PCR结果显示,PsSAK1在游动孢子阶段,休止孢阶段及早期侵染阶段上调表达。另外,PsSAK1也受过氧化氢及氯化钠介导的氧胁迫和渗透压(盐)胁迫诱导上调表达。为了详细研究该基因的功能,我们利用大豆疫霉稳定转化系统,获得了该基因的沉默突变体。PsSAK1的沉默并没有影响菌丝生长速度,孢子囊及卵孢子的形成和产量但是严重影响了游动孢子的发育过程。与野生型相比,PsSAK1的沉默突变体游动孢子休止显著提前,萌发率显著下降,而且不能侵染创伤和未创伤的大豆感病寄主的叶片。进一步显微观察发现,PsSAK1的沉默突变体能够萌发的休止孢所产生的芽管明显长于野生型及对照菌株,而且其芽管不能穿透寄主表皮细胞。上述结果表明,PsSAK1是一个调控大豆疫霉游动孢子发育及致病性的关键因子。促有丝分裂原蛋白激酶PsMPK1参与调控大豆疫霉形态建成和致病过程：本章研究,我们鉴定了一个PsMPK1基因。该基因在产孢菌丝及侵染早期(6h)上调表达,编码一个典型的促有丝分裂原蛋白激酶,而且在已测序的卵菌中是高度保守的。我们利用大豆疫霉稳定转化系统将该基因沉默并获得了三个沉默转化子(T21、T40和T64)。在生物学性状上与野生型相比,PsMPK1沉默突变体的生长速度显著降低,菌落气生菌丝更为致密,游动孢子产量也显著降低,但是游动孢子的游动行为没有受到显著影响,具有正常的趋化性,休止孢萌发正常。有性生殖也没有变化,卵孢子形态及产量与野生型没有差异。另一个重要的差别是,PsMPK1沉默突变体在较短的液体培养时间内就产生大量普遍的菌丝变态结构一菌丝膨大体,而野生型菌株及对照转化子却观察不到这一现象。随后的原生质体释放实验表明,PsMPK1的沉默确实影响到了大豆疫霉的细胞壁,从而使得PsMPK1沉默突变体对细胞壁降解酶葡聚糖酶(glucanase)和纤维素酶(cellulose)变得更为敏感。致病性测定结果表明,PsMPK1沉默突变体无论用游动孢子悬浮液还是菌丝块接种,只能够成功侵染表面创伤的大豆叶片,而不能侵染没有创伤的叶片。