论文部分内容阅读
目的:研究IGF-I是否可以延缓体外培养的大鼠终板软骨细胞衰老与凋亡。方法:大鼠腰椎终板软骨细胞离体培养并传代,取P2代细胞进行相关实验。以COL-2A的mRNA相对表达含量为观察对象,探索IGF-I的作用浓度与时间。IGF-I(20ng/ml)培养终板软骨细胞,观察细胞表型及信号通路变化;同时加入PI3K/AKT信号通路阻断剂(LY2940020)或MAPK/ERK信号通路阻断剂(U0126),观察信号通路蛋白变化。然后取青年,中年和老年三个年龄段大鼠椎间盘,组织学染色观察不同年龄段大鼠椎间盘的形态。分离青年大鼠腰椎脊柱终板软骨原代细胞培养并进行传代,从P2代细胞开始,每三天传代一次,直到P6代,传代同时设置IGF-I刺激细胞实验组;HE、甲苯胺蓝和细胞骨架染色来观察细胞形态变化;western blotting和real-time qPCR分别检测软骨细胞中COL-2A,Sox9,MMP13的蛋白和mRNA表达水平,同时western blotting检测active caspase3的表达变化;多种实验方法来检测IGF-I刺激细胞后的ERK和AKT信号通路的激活。结果:时间与浓度梯度实验中,IGF-I(20ng/ml)作用24h时可增加大约2.5倍COL-2A的mRNA表达,MMP-13的蛋白表达含量明显减少,SOX9蛋白表达明显增加。AKT和ERK1/2都于15min时磷酸化最强,ERK1/2于30min时磷酸化明显减弱,AKT于60min时磷酸化明显减弱,p-ERK核内与细胞质都磷酸化增加,而p-AKT主要表现为细胞核内含量增加。软骨终板表现出与年龄相关的退行性改变。随着体外培养传代次数增加,单层培养细胞也表现出明显的表型和形态学的变化。同时,作为凋亡的标志基因,active caspase3在体外传代的P6代也可以检测出来。IGF-I可以明显提高COL-2A,Sox9,P-ERK,P-AKT的表达,减少MMP13,active caspase3的表达。更重要的是,pERK和pAKT主要表现在细胞核内含量的增加。结论:PI3K/AKT可参与IGF-I引起的COL-2A的表达,而MAPK/ERK调节Sox9、MMP13表达。从某种程度上说,体外培养引起的细胞衰老和凋亡可以在一定程度上模仿体内因为年龄而引起的细胞衰老和凋亡。IGF-I处理后可以延缓终板软骨细胞的衰老和凋亡,且可能通过ERK和AKT信号通路。