【摘 要】
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目的:梯度纳米结构钛（gradient nanostructured surface titanium,GNS Ti）促进人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）成骨分化能力优于纯钛（titanium,Ti）,从转录因子角度对GNS Ti促进hBMSCs成骨分化的分子生物学机制进行探讨,为GNS Ti种植体应用于口腔临床治
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（NO.81970980）；
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目的:梯度纳米结构钛（gradient nanostructured surface titanium,GNS Ti）促进人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）成骨分化能力优于纯钛（titanium,Ti）,从转录因子角度对GNS Ti促进hBMSCs成骨分化的分子生物学机制进行探讨,为GNS Ti种植体应用于口腔临床治疗提供理论及实验依据。研究方法:1.材料的制备与处理:实验组为原始医用金属纯钛板经双面表面机械研磨处理后切割成直径为20mm,厚度为2.5mm的GNS Ti,对照组为相同尺寸的Ti。GNS Ti与Ti依次使用丙酮、36%-38%稀盐酸、无水乙醇、蒸馏水超声荡洗20分钟,干燥,高温高压灭菌。2.hBMSCs与材料共培养及成骨诱导:将GNS Ti和Ti材料置于12孔板内,均匀接种1×105个hBMSCs到材料表面,将孔板静置于37℃5%CO2恒温培养箱中2h后每孔加入1m L培养液覆盖材料。细胞融合度达到80～90%时,更换成骨诱导液,每3天换液。3.hBMSCs接种于GNS Ti与Ti表面后成骨诱导7d、14d、21d,提取总蛋白,Western blot检测两组细胞内核转录因子A（nuclear factor Y-A,NFYA）表达。4.采用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）转染法,转染si-NFYA及转染效率检测:hBMSCs接种于12孔板中培养,细胞融合度达60～70%时转染si-NFYA,6h后流式细胞仪检测转染效率。48h后,RT-q PCR检测NFYA的m RNA表达水平。5.hBMSCs接种于GNS Ti与Ti表面,转染si-NFYA后进行成骨诱导,通过碱性磷酸酶活性、RT-q PCR检测成骨相关m RNA和Western blot检测成骨相关蛋白表达来检测NFYA对hBMSCs成骨分化功能的影响。6.双荧光素酶报告基因实验检测NFYA对I型肌肉样蛋白（muscleblind-likeprotein I,MBNL1）启动子活性的调控关系。7.免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）实验验证MBNL1与骨形态发生蛋白2型受体（bone morphogenetic protein receptor 2,BMPR2）结合关系,转染si-MBNL1后Western blot检测BMPR2蛋白表达以确定MBNL1与BMPR2上下游关系。8.hBMSCs接种于GNS Ti与Ti表面,转染si-NFYA后进行成骨诱导,RT-q PCR和Western blot分别检测MBNL1、BMPR2 m RNA及蛋白表达。结果:1.Western blot检测结果表明:成骨诱导第7、14、21d,GNS Ti表面hBMSCs中NFYA表达量均显著高于Ti组。2.si-NFYA转染hBMSCs具有较高的转染效率,转染si-NFYA后GNS Ti与Ti表面hBMSCs后,GNS Ti si-NC组碱性磷酸酶活性、成骨相关m RNA及成骨相关蛋白表达明显高于Ti si-NC组,且GNS Ti si-NFYA组与Ti si-NFYA组碱性磷酸酶活性、成骨相关m RNA及成骨相关蛋白表达均较各自NC对照组降低。3.双荧光素酶报告基因实验结果表明:p GL3-MBNL1+p RLTK组相较于p GL3-basic+p RLTK组荧光素酶活性明显升高,p GL3-MBNL1+pc DNA3.1-NFYA+p RLTK组相较于p GL3-MBNL1+p RLTK组荧光素酶活性降低。转染si-NFYA后,RT-q PCR及Western blot结果分别显示成骨诱导第7、14、21d,GNS Ti si-NFYA组与Ti si-NFYA组MBNL1 m RNA及蛋白表达量均较各自NC组增高。4.Co-IP实验结果表明:抗BMPR2及抗MBNL1抗体进行的免疫沉淀中,Input、IP组检测到条带,而Ig G组无条带。转染si-MBNL1后,GNS Ti si-NFYA组与Ti si-NFYA组在成骨诱导7、14、21d BMPR2蛋白表达量均较各自NC组显著增加。5.转染si-NFYA后,RT-q PCR及Western blot结果分别显示成骨诱导第7、14、21d,GNS Ti si-NFYA组与Ti si-NFYA组BMPR2 m RNA及蛋白表达量均较各自NC组降低。结论:1.NFYA参与GNS Ti促进hBMSCs成骨分化过程。2.si-NFYA转染明显抑制GNS Ti和Ti表面hBMSCs的成骨分化。3.NFYA负调控MBNL1启动子活性且NFYA负调控MBNL1表达。4.MBNL1和BMPR2直接结合且BMPR2为MBNL1下游靶标。5.NFYA正调控BMPR2表达。
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