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第一部分，慢性高眼压动物模型的建立和评估 目的:探讨建立稳定的大鼠慢性高眼压模型的方法。方法:成年雄性SD大鼠(250g左右)60只,以右眼为高眼压眼,手术显微镜下分离上直肌两侧及鼻下方的3根巩膜上静脉,缝线结扎后缝合球结膜。左眼为对照眼,除不结扎静脉外,其它操作相同。分别于术后30min、1d、3d、5d、7d、10d、14d、28d、35d和42d用Tono-penXL笔式眼压计测量眼压并记录,测量时间为上午10点-11点。于术后2w和4w处死大鼠,处死前5天经上丘行DiI逆行标记RGCs,制作视网膜铺片,正置荧光显微镜观察并计数分析各组视网膜神经节细胞(retinalganglioneells,RGCs)存活情况。结果:对照眼的平均眼压为13.4士0.27mm,术后30min、1d和3d检测高眼压眼的眼压分别为21.4±0.25mmHg、25.5±0.27mmHg和23.4±0.19mmHg,第5天达到最高值,为27.0±2.31mmHg。随后眼压缓慢下降,第7d、lOd、14d和28d分别测得眼压值为:26.4±2.01mmHg、26.8±1.83mmHg、25.6±0.21mmHg和23.6±0.17mmHg,上述各时间点测得的眼压数值与对照组相比均具有显著性差异(P＜O.01)。术后第35d和42d时眼压降至正常范围,分别为14.7±0.31mmHg和15.9±0.26mmHg。视网膜铺片DiI逆行标记计数分析RGCs结果显示,对照眼RGCs的平均密度2201.45土124.67个/mm2,术后2周和4周,高眼压眼RGCs的密度显著减少,分别降到1974.30土108.81个/mm2和1732.96土89.14个/mm2,均明显少于对照眼(P＜0.01)。结论:结扎3条巩膜外静脉可以成功诱导SD大鼠慢性高眼压,并可使眼压稳定维持到4周,是目前慢性高眼压青光眼实验研究中较为便捷、实用和可靠的建立动物模型的手段。经大鼠上丘DiI逆行标记RGCs,结合形态学观察,可以有效示踪RGCs的形态和数量,是研究实验条件下。RGCs数量变化的较为理想的方法。 第二部分，大鼠慢性高眼压模型中视网膜SonicHedgehog(Shh)信号通路分子表达的研究 目的:研究SonicHedgellog及其下游信号通路分子Smootllened(Smo)、Parched(Ptc)和G1i1在正常及慢性高眼压大鼠视网膜组织中的表达及变化。方法:雄性SD大鼠60只,右眼为高眼压组,结扎3根巩膜上静脉；左眼为对照组,除不结扎静脉外,其它操作相同。建模成功的大鼠,分别于3d、1w、2w、4wr各处死15只。其中3只用于视网膜Shh、受体Smo、Ptc以及核转录因子G1i1的免疫荧光或免疫荧光双标染色,正置荧光显微镜观察呈现阳性荧光表达的细胞类型、数量及荧光强弱等；6只用于Westem-blot方法定量检测视网膜组织中上述四种蛋白的表达情况。余下6只大鼠视网膜用于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-timefluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction,Real-1JmePCR),定量分析高眼压视网膜组织中Shh、Smo、Ptc和Glil的mRNA表达变化。Western-blot和Real-timePCR数据采用spssl4.0软件包进行统计分析,进行正态性检验、方差齐性检验,描述性统计值以平均值圭标准误(x±s)表示。两组之间配对资料的t检验,组间差异比较用One-wayANOVA,P＜0.05有统计学意义。结果:免疫荧光双标显示:对照组大鼠视网膜Shh主要在RGCs表达,内丛状层也可见到弱阳性的表达；2w时,高眼压组在RGCs、内丛状层和外丛状层都可以检测到Shh表达,荧光强度明显增加。对照组Gl订和Smo在RGCs的细胞质中有弱阳性表达,高眼压组Glil阳性荧光信号同时出现在RGCs细胞质和细胞核中。Real-timePCR结果显示1w、2w、4w高眼压组ShhmRNA分别是对照组的2.6±0.7、4.4±0.9和2.1±0.5倍,各时间点同对照组相比,差异有显著性(P＜0.01),Smo和GlilmRNA表达量于成模后1w开始升高,并于2w时到达高峰,随后又减少,与对照组相比,差异均有显著性(P＜0.01)。Ptc的蛋白和mRNA表达量在高眼压组和对照组未见明显差异。Western-blot结果显示高眼压组在1w、2w和4w视网膜Shh蛋白分别是对照组的2.1±0.3、4.4±0.6和3.0±0.7倍(P＜0.01),并于2w时达到高峰。视网膜Smo和Giil订蛋白表达量在1w时开始增高,2w时到达高峰,随后下降。在1w、2w和4w时,Smo蛋白表达分别是对照组的3.2±0.4倍(P＜0.05)、3.4±0.6倍(P＜0.01)和l.4±0.2倍(P＞0.05)；Glil蛋白表达量分别是对照组的1.6±0.1倍(P＜0.05)、2.5±0.3倍(P＜0.05)和2.0±O.5倍(P＜0.05)。结论:大鼠慢性高眼压动物模型视网膜组织中Shh及Smo、Glil表达水平升高,Glil在RGC中呈现核转位表达。提示慢性高眼压时视网膜Shh信号转导通路激活,可能参与慢性高眼压视网膜视神经损伤修复的生理病理过程。 第三部分:Shh信号转导通路对大鼠慢性高眼压RGCs损伤的作用及机制研究 目的:研究Shh信号转导通路对大鼠慢性高眼压RGCs损伤的作用,并探讨其可能分子机制。方法:成年雄性SD大鼠以右眼结扎3条巩膜上静脉诱导高眼压形成。按照玻璃体腔内注射药物或浓度的不同将大鼠随机分为9组:不注射组、lOug/mlShh-N组、50ug/mlShh-N组、100gg/mlShh-N组、1.0ug/mlcyclopamine(Shh阻滞剂)组、5.0ug/mlcyclopamine组、5.0ug/mltomatidine组(与Cyclopamine有相似的化学结构,但不能抑制Shh信号转导通路,)、0.1M磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline,PBS)组、和45％(w/v)2一羟丙基一环糊精(2-hydroxypropyl-cyclodextrin,HBC)组,注射体积均为2u1。每周重复注射一次。检测时间点为玻璃体腔注射后1w、2w和4w。在动物处死前5d,行DiI逆行标记RGCs。制作全视网膜铺片正置荧光显微镜观察RGCs的存活及数量,并提取视网膜蛋白和总RNA行Western.blot和Real-timePCR检测信号通路中各成分含量的变化。结果:眼压升高后2w和4w时,玻璃体腔内注射100gg/mlShh-N组RGCs丧失率为分别为4.54+0.36％和9.67土0.31％,与PBS组(15.26土1.57％,22.58土1.97％)相比差异有显著性(P＜0.01)；注射Shh-N50ug/mlRGCs丧失率分别为7.31土0.39％和12.67土O.29％,与PBS组(15.26土1.57％,22.58土1.97％)相比差异也有显著性(P＜0.05)；注射10ug/mlShh-N组RGCs丧失率与PBS组相比无显著性差异。玻璃体腔注射1.0ug/mlCyclopamine组RGCs丧失率分别为19.29土0.43％(P＜O.05)和26.4士2.04％(P＜0.05),5.0ug/mlCyclopamine组RGC丧失率分别为25.2+0.29％和30.7+0.31％,与HBC组相比差异均有显著性(P＜0.01)。注射tomatidine组与注射PBS组相比,RGCs的丧失率无统计学差异。HBC组与未注射组RGCs数量无统计学差异。Shh对损伤RGC的保护作用及Cyclopamine的阻断效应均呈剂量相关性,高浓度组效果更加显著。玻璃体腔注射Shh-N2w后,WesternBlot结果显示高眼压眼视网膜Smo和Glil蛋白表达量增加,Real-timePCR结果:SmomRNA和GlilmRNA分别为对照组的1.52土0.16％倍和1.96土0.31％倍。注射Cyclopamine后,高眼压眼Smo和Glil蛋白和mRNA表达量分别降低。结论外源性和内源性Shh都可以在高眼压引起的RGCs损伤中发挥保护作用,并呈剂量相关性,以高浓度为显著。Shh可能通过释放Smo,激活转录因子Glil发挥神经保护作用。