论文部分内容阅读
慢性牙周炎是一种常见的牙周支持组织丧失的疾病,牙周炎患者常表现为牙齿松动移位,前牙散在间隙,从而影响微笑美学。正畸治疗是改善牙周炎患者微笑美学的有效手段之一。然而,健康牙周组织与炎症牙周组织对正畸力的反应却大不相同,相对于健康组织的“轻力”对于牙周炎患者的牙周组织有可能成为“重力”,这种对正畸力的不同反应与牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）的功能作用息息相关[1]。PDLSCs具有自我更新和多向分化潜能,可以感受力学信号刺激并在机械力刺激下影响牙周组织改建,是研究正畸力作用于牙周组织过程的重要细胞。了解炎症微环境下PDLSCs对不同力学加载引起的组织反应,可以帮助我们理解牙周炎患者牙周组织与健康牙周组织对正畸力反应不同的原因和相关机制,为临床上合理应用矫治力提供理论基础。课题组在前期对PDLSCs加载不同级别静态牵张力（static mechanical strain,SMS）后发现,8%SMS加载时炎症来源PPDLSCs（PDLSCs obtained from periodontal tissues of periodontitis patients,PPDLSCs）成骨分化作用最强,但12%SMS加载时PPDLSCs成骨分化受到了抑制,这与HPDLSCs（PDLSCs obtained from healthy periodontal tissues,HPDLSCs）在12%SMS加载时的成骨分化表现有着极大的差异[2]。这种同一级别SMS加载下的截然不同的成骨分化差异原因,是我们后续研究的重点。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一种无编码蛋白能力且长度超过200nt的RNA,在间充质干细胞分化、信号传递等方面有着重要的调节作用。Zou Y等发现,炎症牙周组织和健康牙周组织之间具有大量差异表达的lncRNA,该团队认为lncRNA可能在炎症微环境中影响PDLSCs的细胞再生及成骨分化功能[3]。因此,我们猜测,lncRNA极有可能也参与调控PDLSCs在机械应力加载下的成骨分化过程,这为我们探索PDLSCs在力学刺激下的成骨分化提供研究方向。基于此,本课题设计了PPDLSCs加载12%SMS后的基因芯片,筛选出大量的在PPDLSCs加载SMS前后差异表达的lncRNA,通过反复验证lncRNA在成骨分化过程中的调控功能,发现LINC00638可以与FGFR1基因竞争性的结合miR-424-5p,从而积极参与调节PPDLSCs在SMS加载后的成骨分化调控。本课题主要包括以下三部分研究:第一部分不同级别SMS对HPDLSCs和PPDLSCs成骨分化作用的影响目的:1.体外培养获得HPDLSCs和PPDLSCs;2.明确不同大小SMS刺激对HPDLSCs和PPDLSCs成骨向分化的影响;3.确定HPDLSCs与PPDLSCs对SMS加载差异表现的目标力值。方法:1.低密度法纯化获得HPDLSCs和PPDLSCs;流式细胞仪鉴定细胞属性;应用克隆团块,结晶紫染色和CCK-8检测各组细胞增殖能力,绘制生长曲线;通过成骨成脂诱导分化后的茜素红和油红O染色,鉴定细胞多向分化潜能;2.利用Fx-4000T系统构建SMS加载细胞模型;CCK-8检测不同级别SMS加载后HPDLSCs和PPDLSCs的细胞增殖活性;PCR与茜素红染色检测SMS刺激后HPDLSCs和PPDLSCs的成骨向分化能力。结果:1.体外成功获得HPDLSCs和PPDLSCs;两组细胞阳性表达间充质干细胞表面标记物Stro-1,CD146,阴性表达造血系标记物CD31和CD14。表明HPDLSCs与PPDLSCs皆为间充质干细胞来源;结晶紫染色结果显示,与HPDLSCs相比,PPDLSCs的克隆形成率显著增高;CCK-8检测显示PPDLSCs整体生长速度大于HPDLSCs;2.茜素红染色结果显示,与HPDLSCs相比,PPDLSCs形成的矿化结节面积较小,且更加分散,着色亦较HPDLSCs浅;油红O染色结果显示PPDLSCs成脂分化能力较HPDLSCs弱;3.应用FX-4000T系统成功建立SMS细胞加载模型;CCK-8结果显示:在8%SMS加载后,PPDLSCs的增殖活性被激活,但在12%SMS加载后,PPDLSCs的增殖受到了抑制;8%SMS和12%SMS均可以促进HPDLSCs增殖,12%SMS组增殖程度最高;4.PCR及矿化结节定量分析显示:12%的SMS对HPDLSCs而言可以促进其成骨分化,但对PPDLSCs却无促进成骨分化的作用。结论:1.体外获得的HPDLSCs和PPDLSCs系间充质干细胞来源;PPDLSCs的成骨、成脂分化能力受到炎性环境影响;2.PPDLSCs和HPDLSCs对SMS的反应不同,12%SMS是HPDLSCs和PPDLSCs差异表现最明显的力值。第二部分12%SMS作用下PPDLSCs的lncRNA芯片表达谱的研究及功能分析目的:1.构建PPDLSCs在SMS作用前后lncRNA基因表达谱;2.功能分析差异表达的lncRNA及验证芯片结果。方法:1.PPDLSCs加载12%SMS后,TRIzol提取细胞总RNA,然后扩增每个样本,并沿着整个转录体长度将其转录成荧光cRNA。应用RNeasy Mini Kit提纯cRNA,用NanoDrop ND-1000来测定被标记的cRNA的浓度和活性。应用Agilent DNA微阵列扫描仪清洗、固定和扫描阵列;2.使用Nimble Scan software进行图像数据分析,使用Agilent Gene Spring GX软件（11.5.1 version）执行分层聚类。以P<0.05,Fold Change>2.0作为筛选标准,对差异基因进行数据分组;3.应用KEGG分析、GO分析、CNC分析预测lncRNA可能参与调控的分子通路,生物调节功能;4.应用qPCR技术验证芯片中差异表达的lncRNA。结果:1.散点图、火山图、Heatmap显示出PPDLSCs在加载SMS前后存在大量差异表达的lncRNA和mRNA;其中,有4471个lncRNA表达量上调,6444个lncRNA表达量下调;有7077个mRNA表达量上调,5816个mRNA表达量下调;2.KEGG结果显示,在表达量上调的mRNA中,按照由高到低的评分结果,前十位通路主要是前列腺肿瘤、肿瘤蛋白聚糖合成通路、肌动蛋白细胞骨架通路、MAPK通路、激素分泌相关通路、癌症介导通路、胰岛素耐受通路、病毒致癌通路、长时程增强通路、表皮生长因子受体通路。在表达量下调的mRNA中,评分前十的通路主要有:细胞周期介导、DNA复制、基因同源重组通路、DNA修复、FA-BRCA网络、NOD-like受体信号通路、剪接体、非同源末端连接通路、核苷酸切除修复、碱基切除修复通路;3.GO分析结果显示,分子功能方面:差异表达的mRNA主要参与蛋白质合成、生长因子结合、ATP酶活性激活、损伤DNA修复等方面;生物学过程方面:主要参与信号通路调控、生长发育过程、多细胞组织发育、细胞周期、分子分化等方面;细胞组成方面:主要参与细胞结合、细胞内连接、核分裂、核仁形成等方面;4.CNC分析显示:有多个参与成骨调控通路的分子,如FGFR1、FPR2、DAPK1等可能与差异表达的lncRNA相关;5.ENST00000550947等7个lncRNA的变化趋势与芯片结果趋势基本类似,仅在表达量变化倍数略有不同。TCONS00008000的PCR结果与芯片结果趋势不一致,且差异不具有统计学意义。结论:PPDLSCs在12%SMS加载后产生了大量差异表达的lncRNA和mRNA,其中一部分mRNA与MAPK等成骨调控通路相关。第三部分LINC00638在SMS加载后对PPDLSCs成骨分化作用的研究目的:研究LINC00638在12%SMS作用下对PPDLSCs成骨分化能力的影响,探索LINC00638可能参与PPDLSCs在SMS加载下成骨分化调控的作用机制。方法:1.通过观察成骨调控过程中LINC00638的表达情况,筛选目标lncRNA;2.慢病毒稳定转染细胞,过表达及沉默LINC00638的基因表达,应用PCR、ALP染色、茜素红染色及定量分析检测12%SMS作用下PPDLSCs成骨分化能力的变化;3.沉默LINC00638后检测8%SMS作用下PPDLSCs成骨分化能力;4.生物信息学预测LINC00638的可能作用方式;5.RT-PCR检测下调miR-424-5p后,LINC00638的表达水平以及沉默LINC00638后miR-424-5p的表达水平;ceRNA分析其结合位点;6.RT-PCR和Western Blot检测下调miR-424-5p后,FGFR1的表达;观察过表达及沉默LINC00638后,FGFR1的表达。结果:1.确定LINC00638为我们的目标lncRNA;在转染过表达LINC00638慢病毒后,LINC00638的表达量升高了3.25倍,在转染沉默LINC00638慢病毒后,相对于NC组,LINC00638的表达量下降了2.67倍;2.PPDLSCs加载12%SMS 12h后,PCR检测结果显示:在过表达LINC00638后,12%SMS+LINC00638组较对照组的Runx2、ALP、Col1的基因表达量明显增加（P<0.05）,其中Runx2增加表现的最明显;在沉默LINC00638后,12%SMS+LINC00638 RNAi组的基因表达量较对照组有所下降（P<0.05）。ALP染色和茜素红染色结果也佐证了这一趋势;3.沉默LINC00638后,在8%SMS组的Runx2、ALP、Col1的表达也发生了下降,ALP和茜素红染色的结果与之趋势相同;4.生物信息学预测结果显示,LINC00638可以与FGFR1竞争吸附miR-424-5p,形成ceRNA效应。5.anti-miR-424-5p可以有效降低PPDLSCs中miR-424-5p的表达。与此同时,LINC00638的表达水平有所增加（1.65倍）;在转染LINC00638 RNAi后,miR-424-5p的表达量同样有所上升;6.过表达LINC00638可以促进FGFR1的基因及蛋白表达;沉默LINC00638则会抑制FGFR1的基因和蛋白表达。结论:1.LINC00638充分参与了12%SMS作用下PPDLSCs的成骨分化调控,过表达LINC00638可以在体外促进PPDLSCs在12%SMS刺激下的成骨分化;2.沉默LINC00638可以抑制8%SMS作用下PPDLSCs成骨分化能力;3.LINC00638可能与miR-424-5p形成负向环路,参与到FGFR1调控成骨分化过程中来。