论文部分内容阅读
临床流行病学资料统计显示,脓毒症是临床危重患者的重要死亡原因,革兰氏阴性杆菌细胞壁毒性成分—LPS是导致脓毒症的主要致病因子之一。既往我们主要针对LPS受体在脓毒症发病机理中的作用开展了大量探索性研究,现已明确TLR4/CD14/MD-2是机体识别LPS的关键模式受体,CD14/TLR4基因多态性在脓毒症的易感性及预后方面发挥了重要作用。MD-2是LPS激活细胞的重要参与分子,但该基因多态性在中国人群中的分布以及在脓毒症易感性中的作用尚不清楚。为此,本研究课题用生物信息学方法筛选出MD-2基因启动子区可能影响基因表达的SNP位点,然后以中国重庆地区汉族人群为研究对象,采用RFLP方法对SNP发生及分布频率进行检测分析,通过构建SNP位点不同等位基因启动子载体,以双荧光素酶报告系统观察SNP对MD-2基因启动子活性的影响,并以定量PCR方法检测不同基因型个体MD-2mRNA表达水平高低,最后探讨了不同等位基因个体全血对LPS刺激的反应性差异。主要结果与结论如下: 1.生物信息学分析显示,MD-2基因启动子区-3000bp内有8个SNP位点,其中-1625C→G,-1064A→G,-475A→T三个SNP位点碱基变异可以影响MD-2基因启动子区与转录因子的结合活性。 2.对711名重庆地区汉族健康人群的SNP调查分析显示,MD-2基因启动子区存在-1625C→G和-1064A→G碱基变异,发生频率分别为19.84%和34.71%,均为高频SNP。未见-475位点A→T碱基变异。 3.通过PCR和定点突变技术,构建了含MD-2基因-1704~+61区域启动子及-1625G和-1064G启动子质粒,化学发光结果显示,在U937细胞中,-1625G启动子活性明显高于-1625C启动子活性,-1064A启动子与-1064G启动子活性无明显差异。说明-1625 C→G碱基变异可增强MD-2基因启动子活性,而-1064A→G碱基变异对靶基因启动子活性无明显影响。 4.定量PCR结果显示,-1625GG纯合子个体MD-2mRNA表达水平显著高于-1625CC纯合子个体,-1625GC杂合子个体MD-2mRNA表达水平也高于→1625CC纯合子个体,进一步说明了-1625C→G碱基变异可通过影响基因启动子活性而增强基因表达。 5.以LPS刺激不同基因型个体全血,-1625GG基因型个体TNF-α产生水平最高,CG基因型次之,而CC基因型TNF-α产生水平最低,提示-1625C→G碱基变异能显著增强个体一内毒素反应性。说明该SNP对于临床脓毒症易感性的判定具有重要意义。