小热激蛋白(small Heat shock protein, sHsp)是一种应激诱导的分子伴侣,分子量大约在12～43 kDa,sHsps家族在序列和大小上变化很大,但在结构上有以下几种共同的特征:1、含高度保守的α-crystallin区域;2、半胱酸的含量低于其他蛋白家族;3、能够形成大的、动态寡聚体结构;4、具有抑制蛋白聚集的分子伴侣活性。实验选取目前已发现的家蚕小热激蛋白家族中最小蛋白sHsp19.9,经过生物信息学分析,它含有高度保守的α-crystallin结构域和疏水的结合位点。据此,分别构建全长及缺失N末端1-24和1-62氨基酸残基的三个pET-28a表达载体,转化E.coli BL21-Star,表达融合蛋白sHsp19.9-FL、sHsp19.9-△1和sHsp19.9-△2,包涵体变性后用金属镍柱亲和层析纯化,并经过Sephedex G-150凝胶柱复性后得到纯蛋白。将纯化的融合蛋白sHsp19.9-FL免疫雄性新西兰兔,获得多克隆抗血清,ELISA检测效价为1:12 800。经还原与非还原SDS-PAGE和免疫印迹技术(Western blot)鉴定,三种蛋白均通过链间二硫键形成了二聚体。经胰蛋白酶(trypsin)敏感实验,三种蛋白均有不同程度的降解,表明三种蛋白均未形成稳定的寡聚体结构。通过柠檬酸合酶(CS)的热聚集实验和溶菌酶(lysozyme)DTT诱导的聚集实验证实全长的小热激蛋白(sHsp19.9-FL)具有分子伴侣活性,而另外两种蛋白不具有分子伴侣活性。这一实验结果,为体外研究家蚕小热激蛋白功能和结构的关系奠定基础。将吐丝期、蛹期家蚕经热刺激处理后,在室温孵育不同时间,经Western blot和半定量ELISA检测提取的总蛋白后,发现孵育不同时间的蛋白表达量变化幅度不一致,热激处理后的表达量高于未热激的。提取家蚕五龄幼虫的各组织总蛋白和总RNA,利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术和Western blot分别从mRNA转录水平和蛋白翻译表达水平分析,结果显示,表达量丰富的是生长发育旺盛的精巢组织,表达量远高于其它组织,表明该小热激蛋白与细胞分裂与分化等生命活动有一定联系。小热激蛋白sHsp19.9在家蚕体内的应激表达和组织特异性分析结果,可为进一步研究其功能作用机制提供依据。