广西猪增生性肠炎病原的初步研究

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猪增生性肠炎(PPE)是由胞内劳森氏菌(Lawsonia Intracellularis,LI)引起的接触性传染病,是一种具有重要经济意义的世界性疾病。该病呈全球性流行,国内临床可疑病例有增多趋势,猪群感染率高。胞内劳森氏菌宿主广泛,是猪肠道疾病综合征(PEDC)的关键性病原之一,对全球养猪业造成巨大经济损失。因此,了解PPE的流行情况并研究其病原,对防制该病和促进养猪业的健康发展具有重要意义。本研究优化了猪增生性肠炎的PCR诊断方法,能用于活体检测。从疑似病变的猪回肠中扩增出胞内劳森氏菌的基因,与GenBank上各株胞内劳森氏菌核苷酸同源性在98.9%~100%之间,证实广西猪群存在猪胞内劳森氏菌的感染;对广西猪群增生性肠炎调查显示,屠宰猪和断奶仔猪平均感染率分别为15.6%和13.5%,应引起重视。以感染猪回肠粘膜为材料,成功将本研究所得的GXNN株胞内劳森氏菌接种到兔体。动物感染试验表明,猪源胞内劳森氏菌可以用兔体接种保存,该菌可以人工感染小鼠;GXNN株胞内劳森氏菌对兔子和小鼠致病性相似,初步建立其动物感染模型。将GXNN株胞内劳森氏菌接种到猪后能复制出PPE,表明该菌是PPE的病原。对人工感染猪组织进行HE切片染色,证实胞内劳森氏菌可以引起猪回肠、结肠腺窝上皮细胞的增生。设计特异性引物,克隆GXNN株胞内劳森氏菌的16SrRNA基因。核苷酸同源性分析显示,GXNN株与不同动物源性胞内劳森氏菌16SrRNA核苷酸同源性在98.4%~100%;与其他种类原核微生物16SrRNA核苷酸同源性在71.8%~88.6%。克隆GXNN株胞内劳森氏菌的三个外膜蛋白基因和一个表面脂蛋白基因(LI1022,LI1024,LI0902,LI0235),与已发表菌株AM180252核苷酸同源性分别为99.8%,99.5%,99.8%,99.8%;氨基酸同源性分别为99.4%,98.8%,99.3%,98.9%。分别将四个基因连接至PET32a+载体并转化至BL21,经酶切鉴定和序列测定后表明插入位置正确。分别挑取单个阳性菌落,于20℃下以终浓度1.0mmol/L IPTG诱导5h,并用抗6xHis标签单抗进行Westernblotting检测,结果表明PET32a+-LI1022、PET32a+-LI0902融合蛋白得到表达。用感染兔血清对PET32a+-LI1022融合蛋白进行Western blotting检测,初步表明该蛋白具有抗原性。
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