目的考察组蛋白去乙酰化酶的高效抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的保护作用,并对其相关机制进行初步探讨,为临床治疗新生儿缺血缺氧性脑损伤提供理论依据。方法1.取7日龄新生的SD(Sprague-Dawley)大鼠,11-18g,雄雌不限,随机分为三组,即假手术组(Sham)、缺血缺氧组(HIBD)、干预组(TSA)。参照经典的Rice法并稍作改进建立新生大鼠缺血缺氧性脑损伤模型;2.采取TTC染色法检测各组新生大鼠的脑组织梗死体积;3.采取自主活动实验检测各组新生大鼠的自主活动能力;4.采取Morris水迷宫实验检测各组新生大鼠远期的空间学习记忆能力;5.通过RT-PCR实验检测在新生大鼠HIBD后三个不同时间点KCC2 m RNA的表达变化;同时检测Neu N和KCC2 m RNA在脑损伤后的下降比例;检测各组新生大鼠REST、Co REST、HDAC1、KCC2的m RNA表达变化;6.采用Western blot法、免疫组织荧光法考察TSA发挥脑保护作用的相关机制。结果1.缺血以后,新生大鼠皮肤颜色变浅,呈现苍白色,但在短时间内皮肤颜色即可恢复正常;在缺氧过程中,新生大鼠皮肤颜色加深,焦躁不安并伴随有抽搐现象;在HIBD模型建立后,大鼠走路不稳并向左侧旋转,对外界的刺激反应迟钝。2.TTC染色结果显示:与假手术组对比,HIBD组脑组织具有非常明显的苍白色区域,表明建造的新生大鼠HIBD模型是成功的。TSA干预组的脑组织显示的苍白色区域与HIBD组相比明显减小,表明TSA对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤具有一定的近期保护作用。3.自主活动实验结果显示:与假手术组相比,测得的HIBD组大鼠的自主活动次数明显减少,而TSA干预组新生大鼠的自主活动次数与HIBD组相比明显增多,表明TSA能提高新生大鼠HIBD的中枢兴奋性。4.Morris水迷宫实验结果显示:(1)定位航行实验结果显示:各组动物的平均逃避潜伏期在第一天时基本相同,第三天开始出现明显差异,到第五天时则表现出显著地统计学差异,统计结果为HIBD组>TSA组>sham组。(2)空间探索实验结果显示:与假手术组相比,缺血缺氧组大鼠测得的穿越站台的平均次数和在目标象限停留的平均时间百分比都明显降低,而给予TSA干预后,测得的两者的数值则均有一定的提高,表明缺血缺氧性脑损伤可严重影响新生大鼠的空间学习记忆能力,给予TSA干预则能明显的改善脑损伤大鼠远期的空间学习记忆能力。5.RT-PCR结果:(1)首先,检测新生大鼠HIBD后三个不同时间点KCC2 m RNA的表达变化,结果显示在缺血缺氧性脑损伤后第三天时KCC2m RNA的表达变化最为明显,因此在以后的分子学实验中选择这个时间点进行相关实验操作。(2)在新生大鼠HIBD后第三天时同时检测Neu N和KCC2 m RNA的表达变化,结果显示KCC2表达下降比例明显高于Neu N,表明KCC2 m RNA在新生大鼠缺血缺氧性脑损伤中的表达下降主要是由神经元的损伤引起的,而不是神经元的死亡造成的。6.分别检测三组新生大鼠REST、Co REST、HDAC1、KCC2 m RNA的表达变化,结果显示与假手术组相比,缺血缺氧组REST、Co REST、HDAC1 m RNA表达明显升高,KCC2 m RNA表达则显著下降。给予TSA干预,抑制REST、Co REST、HDAC1 m RNA表达,阻止了KCC2 m RNA表达的下调。7.Western blot实验结果显示:与假手术组相比,HIBD后REST、Co REST、HDAC1蛋白的表达明显升高,而KCC2蛋白的表达则显著下降。给予TSA干预,抑制REST、Co REST、HDAC1蛋白的表达,阻止了KCC2蛋白的表达下调。免疫组织荧光实验的测得的结果与Western blot一致。结论本课题研究发现TSA对新生大鼠HIBD有一定的近远期脑保护作用,其药物作用机制是抑制转录复合物REST/Co REST/HDAC1,通过表观遗传学调控阻止脑缺血缺氧后KCC2的下调,维持了神经元内Cl-的稳态,进而发挥脑保护作用。