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Fli-1是ETS转录家族的成员之一，参与调节癌症的起始和进程，包括：无限增殖、造血作用、基因组不稳定性、抑制凋亡和阻滞分化，其不正常表达或易位能诱导多种类型肿瘤的发生。尤为重要是，已有研究证据表明Fli-1调控造血干细胞和造血祖细胞的分化，高表达Fli-1的免疫细胞其微环境有助于白血病细胞的体内外扩增。因此，本研究课题基于Fli-1作为一个抗肿瘤的潜在治疗靶点，从天然产物提取物来源的化合物中筛选出具有Fli-1抑制作用的小分子先导化合物，并采用红白血病细胞和 F-MuLV 诱导的红白血病小鼠模型对其进行抗红白血病活性的初步评价。经过筛选，本研究获得一组在体内外均具有显著抗红白血病活性的flavagline类化合物4′-demethoxy-3′,4′-methylenedioxy rocaglaol（A1544）和rocaglaol （A1545）；进一步从诱发细胞凋亡和促进细胞分化等方面阐明 flavagline 类化合物对红白血病的抑制作用，并解释其中可能参与的分子机制。
主要研究内容和结果如下：
①A1544和A1545抑制肿瘤活性上的表现：A1544和A1545抑制了高表达Fli-1细胞株 CB7、HEL、Daudi、MM1.S 和 RPMI8226 的增殖作用。我们发现 A1544和A1545阻滞小鼠和人红白血病细胞细胞周期由G0/G1期向S期的转化。在红白血病小鼠模型中，A1544和A1545延缓了红白血病小鼠的发病进程。
②Fli-1敲减的HEL、Daudi、MM1.S和RPMI8226细胞生长增殖受到抑制， Fli-1沉默HEL细胞株出现凋亡现象。A1544和A1545在转录后水平抑制Fli-1的表达，A1544和A1545能通过下调Fli-1表达抑制红白血病细胞的生长增殖。
③A1544和A1545降低了红白血病细胞的线粒体膜电位，诱导红白血病细胞发生凋亡。A1544和A1545导致细胞凋亡可能的一条路径是化合物作用于红白血病细胞后，促凋亡蛋白bax上调和抑凋亡蛋白BCL2下调，引起线粒体膜电位降低，进一步caspase 9活化形成cleaved caspase 9，然后召集并激活形成cleaved caspase 3并作用于PARP1，激活细胞内部线粒体凋亡途径。A1544和A1545也下调caspase 8从死亡受体路径诱导红白血病细胞凋亡，同时下调两条凋亡路径的连接蛋白bid。
④分析A1544和A1545在红白血病细胞红系分化上的表现：这两个小分子先导化合物上调了红系分化相关因子 EKLF、β-globin、GATA1、SHIP1、p27KIP1、NFE2基因的表达，但不影响巨核系分化相关基因p21CIP1和PF4基因的表达。采用流式细胞方法分析A1544和A1545处理的HEL细胞，红系分化表面抗原CD71的表达增加，巨核细胞和血小板表面抗原CD41的表达几乎没有变化。类似的结果也在红白血病小鼠体内实验出现，A1544和A1545不同程度地增加了小鼠脾细胞中CD71或TER119的表达。
⑤对信号通路方面的影响：A1544和A1545作用于c-Raf-MEK1/2-ERK1/2通路，下调了MNK1介导的eIF4E磷酸化。A1544和A1545下调survivin的表达与eIF4E的失活有关。
综上所述，本课题基于治疗靶点 Fli-1，筛选鉴定出可用于潜在治疗白血病的小分子flavagline类化合物4′-demethoxy-3′,4′-methylenedioxy rocaglaol（A1544）和rocaglaol（A1545），并进一步研究其抗红白血病活性的分子机制，为红白血病的治疗药物研发提供研究基础和临床前指导。同时，本课题也初步验证了Fli-1作为红白血病治疗靶点的可行性和有效性，并发现 Fli-1 参与了红白血病细胞的增殖， flavagline类化合物或其他Fli-1抑制剂有望应用于高表达Fli-1的多种类型肿瘤的治疗。
主要研究内容和结果如下：
①A1544和A1545抑制肿瘤活性上的表现：A1544和A1545抑制了高表达Fli-1细胞株 CB7、HEL、Daudi、MM1.S 和 RPMI8226 的增殖作用。我们发现 A1544和A1545阻滞小鼠和人红白血病细胞细胞周期由G0/G1期向S期的转化。在红白血病小鼠模型中，A1544和A1545延缓了红白血病小鼠的发病进程。
②Fli-1敲减的HEL、Daudi、MM1.S和RPMI8226细胞生长增殖受到抑制， Fli-1沉默HEL细胞株出现凋亡现象。A1544和A1545在转录后水平抑制Fli-1的表达，A1544和A1545能通过下调Fli-1表达抑制红白血病细胞的生长增殖。
③A1544和A1545降低了红白血病细胞的线粒体膜电位，诱导红白血病细胞发生凋亡。A1544和A1545导致细胞凋亡可能的一条路径是化合物作用于红白血病细胞后，促凋亡蛋白bax上调和抑凋亡蛋白BCL2下调，引起线粒体膜电位降低，进一步caspase 9活化形成cleaved caspase 9，然后召集并激活形成cleaved caspase 3并作用于PARP1，激活细胞内部线粒体凋亡途径。A1544和A1545也下调caspase 8从死亡受体路径诱导红白血病细胞凋亡，同时下调两条凋亡路径的连接蛋白bid。
④分析A1544和A1545在红白血病细胞红系分化上的表现：这两个小分子先导化合物上调了红系分化相关因子 EKLF、β-globin、GATA1、SHIP1、p27KIP1、NFE2基因的表达，但不影响巨核系分化相关基因p21CIP1和PF4基因的表达。采用流式细胞方法分析A1544和A1545处理的HEL细胞，红系分化表面抗原CD71的表达增加，巨核细胞和血小板表面抗原CD41的表达几乎没有变化。类似的结果也在红白血病小鼠体内实验出现，A1544和A1545不同程度地增加了小鼠脾细胞中CD71或TER119的表达。
⑤对信号通路方面的影响：A1544和A1545作用于c-Raf-MEK1/2-ERK1/2通路，下调了MNK1介导的eIF4E磷酸化。A1544和A1545下调survivin的表达与eIF4E的失活有关。
综上所述，本课题基于治疗靶点 Fli-1，筛选鉴定出可用于潜在治疗白血病的小分子flavagline类化合物4′-demethoxy-3′,4′-methylenedioxy rocaglaol（A1544）和rocaglaol（A1545），并进一步研究其抗红白血病活性的分子机制，为红白血病的治疗药物研发提供研究基础和临床前指导。同时，本课题也初步验证了Fli-1作为红白血病治疗靶点的可行性和有效性，并发现 Fli-1 参与了红白血病细胞的增殖， flavagline类化合物或其他Fli-1抑制剂有望应用于高表达Fli-1的多种类型肿瘤的治疗。