论文部分内容阅读
我国是果品生产大国同时也是消费大国,由于采后的储运条件和技术不够完善,采摘后的果实发生后熟、衰老、死亡、腐烂变质,逐渐失去其价值,造成农业生产上的巨大浪费。研究果实的成熟衰老机制,从而提供有效的贮藏技术,一直是人们急切解决的问题。番茄是我国栽培面积最广,消费最多的作物之一,具有极高的营养价值,由于其不耐贮藏,易发生变质腐烂,从而造成巨大的损失,如何延长其采后贮藏期,使番茄的营养价值不受损害,是许多学者关注的课题。近年来的研究结果表明,硫化氢(H2S)能显著地抑制采后果实衰老过程,保持果实新鲜,延长其采后的贮藏期,然而果实在贮藏期间是否依然保持其营养品质不受损害,仍有待探讨。乙烯(C2H4)作为植物内源激素,在采后果实的贮藏期间发挥关键的作用,是果实成熟衰老的重要调控因子,也是人们研究的热点。H2S和C2H4对果实贮藏期的品质影响,尚不是很明确。 本论文以采后番茄果实为实验的材料,分别采用硫氢化钠(NaHS)和乙烯利溶液作为H2S和C2H4的供体,研究讨论了外源H2S和C2H4对采后番茄品质的影响。研究结果表明,H2S处理组与对照组相比较,或者C2H4处理组与H2S和C2H4共同处理组相比较,都可以看出C2H4明显加快番茄变红的速度,而H2S减缓了该速度,使番茄维持较好的色泽。H2S处理抑制了叶绿素的分解、类胡萝卜素、花青素含量的积累,提高了类黄酮、总酚等抗氧化物质的含量,使果实呈现新鲜饱满的状态。同时H2S与C2H4处理时,H2S可以延缓抗坏血酸、可滴定酸、还原糖、可溶性蛋白质、淀粉含量的降解,也显著抑制了蛋白水解酶、淀粉酶的活性。这些说明C2H4处理可以加快番茄果实成熟衰老进程及营养物质的消耗,降低番茄的贮藏品质,而H2S可以减缓果实营养成分的降解,较好的维持番茄果实的商品价值和营养价值,使贮藏期间的品质得到保证,另外H2S可以在一定程度上抑制乙烯的作用,从而延长采后番茄的贮藏期。 同时我们发现与对照组相比,外源H2S的存在,抑制了半胱氨酸合成酶(OASTL)的活性,降低了半胱氨酸合成酶相关基因的相对表达量,且在番茄果实贮藏期间经H2S、C2H4处理后,所检测的与番茄品质相关的指标(叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮、总酚、花青素、抗坏血酸、可滴定酸、还原糖、可溶性蛋白、淀粉、蛋白水解酶和淀粉酶活性)与半胱氨酸合成酶家族基因的表达量,具有较高的相关性。半胱氨酸合成酶是合成半胱氨酸的关键酶,半胱氨酸的生成是植物合成众多具有重要生物学功能的代谢产物的前体物质,半胱氨酸的生物合成能力与植物的抗性、耐受性及其果实的品质有着密切的联系,而这些都由半胱氨酸合成酶进行调控。 因此本文对半胱氨酸合成酶家族基因OASTL1、OASTL2进行了生物信息学分析,主要包括进化树构建、蛋白结构域预测及Motif分析,得到番茄中OASTL1、OASTL2基因分别与拟南芥、烟草、水稻、玉米等物种的相应基因具有较高的同源性,其中OASTL1基因与烟草同源性高达99%,OASTL2基因与拟南芥的同源性达到97%。由蛋白结构域和Motif的分析中得到该基因的功能较为保守。通过构建G FP-OASTL1/OASTL2载体,转染烟草叶片进行亚细胞定位,结果表明OASTL1、OASTL2基因主要定位在植物细胞的叶绿体和胞质内。另外对番茄不同组织中OASTL1、OASTL2基因的表达情况进行定量PCR,得到其在不同组织中的表达量不同,其中叶和果实中的表达量相对较高,这与网站预测结果一致。 近一步构建了OASTL1、OASTL2的Crispr/cas9敲除载体和PBI121超表达载体,转入农杆菌感受态,然后分别侵染番茄的茎和子叶,经植物组织培养,筛选并获得番茄OASTL1和OASTL2的基因缺失植株和过表达植株。然后对番茄过表达植株OASTL基因的表达量进行分析,RT-PCR的结果显示,OASTL1的1号番茄相对于野生型植株OASTL表达量提高了约2倍,2号提高了约4倍,3号提高了约7倍,OASTL2基因1号番茄的相对表达量约是野生型番茄的25倍,番茄过表达植株OASTL基因的表达量相对野生型有不同程度的提高,表明载体在植株体内发挥了相应的作用。最后使用野生型番茄植株和基因OASTL1、OASTL2的过表达植株的茎和叶分别诱导愈伤组织,在重金属镉胁迫下的实验发现,过表达植株的愈伤组织的褐化程度明显低于野生型植株愈伤组织的褐化程度,这说明过表达OASTL基因的番茄植株的愈伤组织在重金属的胁迫下相对野生型具有较强的抵抗作用,过表达OASTL基因增强了植株对重金属的耐受性,初步探究了OASTL基因的功能。