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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)作为常见的临床致病菌,其形成的生物被膜(Bacterial biofilm,BF)和分泌的毒力因子能够促进细菌耐药性和致病性的产生。近年来,从中药中,尤其是清热解毒中药中,寻找抗菌活性物质已成为新型抗生素研发的重要途径。绿原酸作为多种清热解毒中药的主要抗菌活性成分,能够减轻或消除细菌、病毒等病原微生物感染所引起的症状,应用于临床抗感染治疗。研究结果显示,绿原酸经胃肠道菌群和肝脏代谢后,原型物在体内几乎不存在,多以代谢物形式存在,其抗菌作用机制尚不明确。本论文针对绿原酸在体内处于关键代谢节点上的代谢成分,选择近期临床收集的 MRSA 和 PA 进行亚抑菌浓度(Sub-inhibitory concentration,Sub-MIC)下的抗生物被膜以和抑制毒力因子分泌作用的研究,希望找到抗临床耐药菌株MRSA和PA生物被膜活性或降低PA毒力因子分泌的物质基础,为以绿原酸为主要成分的清热解毒中药的临床抗感染治疗提供理论支撑。论文分四部分进行,选择绿原酸(Chlorogenic acid,CA)和8种体内主要代谢物奎宁酸(Quinic acid,QA)、咖啡酸(Caffeic acid,CAA)、苯甲酸(Benzoic acid,BA)、马尿酸(Hippuric acid,HA)、对香豆酸(4-coumaric acid,HCA)、对羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoic acid,HBA)、异阿魏酸(Isoferulic acid,IA)和香草酸(Vanillic acid,VA)进行研究。由于前期实验已对绿原酸及代谢物对PA生物被膜的影响和部分作用机制进行过系统研究,因此,本论文主要针对各代谢物对MRSA产生的生物被膜的影响、作用机制以及各代谢物对PA分泌的绿脓菌素、弹性蛋白酶这些毒力因子的作用和机制进行研究。第一部分:绿原酸代谢产物对MRSA和PA的作用对近期临床收集的MRSA和PA各5株进行抑菌作用研究,采用微量肉汤稀释法测定绿原酸代谢产物对MRSA和PA的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。结果显示:对MRSA的抑菌活性较强的为:对香豆酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸,对PA的抑菌活性较强的为:奎宁酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸。在各5株MRSA和PA受试菌株中,耐药程度相对较强的菌株编号分别为MRSA18-10和PA15-23。其次,在对MRSA18-10和PA15-23生长曲线的研究中,在亚抑菌浓度下,上述抑菌活性较强的代谢物中,除奎宁酸、苯甲酸、对香豆酸和咖啡酸外,其余均对细菌的生长无明显影响,提示在一定的亚抑菌浓度下,奎宁酸、苯甲酸和对香豆酸也具有一定的抑菌能力。第二部分:绿原酸代谢产物对MRSA生物被膜的作用。采用结晶紫染色法,测定在亚抑菌浓度下,代谢产物对MRSA生物被膜的影响。结果显示奎宁酸、苯甲酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸的消除作用较佳。其中,浓度范围奎宁酸、对香豆酸作用浓度范围较广,为1 MIC～1/32 MIC。而在亚抑菌浓度下,香草酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸、奎宁酸、苯甲酸和异阿魏酸抑制MRSA生物被膜生长作用较佳。同时,采用棋盘微量稀释法测定苯甲酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸体外联合抗MRSA,实验结果显示,对香豆酸与苯甲酸联合用药时发生相加作用,对香豆酸与对羟基苯甲酸、苯甲酸与对羟基苯甲酸,联合用药时发生协同增强作用,苯甲酸与对羟基苯甲酸协同作用较强。提示,绿原酸代谢物对香豆酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸应作为抗菌作用的重点研究对象。第三部分:绿原酸代谢产物抑制PA毒力因子分泌的作用。在亚抑菌浓度1/4 MIC～1/16 MIC下,绿原酸、奎宁酸、咖啡酸、马尿酸、对香豆酸、异阿魏酸和香草酸对PA菌绿脓菌素的分泌具有较强的抑制作用,但对弹性蛋白酶分泌的抑制作用较弱,仅绿原酸在MIC浓度下有一定抑制作用。第四部分:绿原酸代谢产物对MRSA和PA的作用机制。采用聚合酶链式反应,测定在亚抑菌浓度下,绿原酸及其代谢物对MRSA和PA群体感应系统(Quorum Sensing,QS)相关基因的调控作用,结果显示对苯甲酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸对agrA为下调作用,但对icaA、icaB、icaD基因有上调作用,对此现象,需更多从基因组合上来进行分析,与文献[1]报道一致。对PA QS系统中主要影响毒力因子分泌的4个基因LasR、LasI、RhIR、RhII,除对香豆酸对LasR、LasI基因有上调,对羟基苯甲酸对LasI、RhlR基因有上调作用外,其余均呈现下调作用。采用分子对接方法,将具有代表性的三个代谢物苯甲酸、对羟基苯甲酸和对香豆酸与MRSA的AgrA蛋白活性位点结合,将奎宁酸与PA的LasR蛋白活性位点结合,探究其抗菌作用机制。结果显示,三个代谢物均可以结合在AgrA蛋白表面,其中对香豆酸对于AgrA蛋白功能的抑制浓度相对较低,可以推测对香豆酸(HCA)对于AgrA蛋白功能的影响相对更大,一定程度上抑制MRSA Agr系统的启动。奎宁酸与LasR蛋白的结合可以竞争性抑制信号分子对LasR蛋白的激活,阻止Las系统启动和下游基因系统启动,从而抑制PA生物被膜生成和减少绿脓菌素、弹性蛋白酶等毒力因子分泌。综上所述,绿原酸的代谢成分苯甲酸、对羟基苯甲酸和对香豆酸三个代谢物通过下调MRSA QS关键基因agrA,影响生物被膜的合成,可能是绿原酸在体内抗MRSA生物被膜的物质基础之一;而奎宁酸、咖啡酸、马尿酸、对香豆酸、异阿魏酸和香草酸多种代谢物则是绿原酸在体内抗PA毒力因子分泌的物质基础之一,具有进一步深入研究的价值。