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基于肽质量指纹谱(peptied mass fingerprinting, PMF)的微生物识别技术是近年来新兴的微生物鉴定技术体系,自从布鲁克公司的Biotyper系统面世以来,PMF技术不断地在各个领域接受验证与评价。因商业化数据库在高致病性的病原微生物相关信息方面的不足,致使许多病原无法识别或识别不理想；目前为止,没有PMF用于病原分型与溯源的流行病学研究,而PMF快速、高通量的特性非常适合于传染病预防与控制,有望成为有效的诊断工具。商业化参考谱数据库主要基于欧洲病原建立,由于地域性因素,我国某些病原基本不识别或识别率低,并且数据库缺乏高致病性病原,严重限制其在传染病预防控制领域的应用。我国自主知识产权的基于PMF的微生物识别系统尚属空白,国内市场不断被国外公司占据,自主知识产权的识别软件系统研发有关国家的重大利益与安全。因此,结合目前PMF的研究现状,本课题拟对PMF技术条件标准化、数据库构建与评价、基于PMF的流行病学、重组病原及体液病原检测方法建立、自主知识产权微生物识别系统开发等四部分进行研究,推进与实现PMF在传染病预防控制领域的应用。在PMF技术条件标准化上,本研究确定,针对商业化的系统,所有菌株都采用预提取法,除芽孢菌采用80%三氟乙酸提取,其它菌均采用乙醇/甲酸预法处理；液体培养的细菌采用一次PBS洗涤后预提法,可满足敏感性与生物安全性的要求,确定现有PMF系统的检测限为10000个细胞。在细菌传代过程中,2,000～20,000Da小肽系列相对保守,即使有个别变化也不会影响依据整体肽系列匹配率的细菌识别判断。因此,在构建标准肽质量参考谱时,无需考虑菌株的代数。采用标准化的技术条件,本研究构建了31个属、94(86种细菌、6种支原体、2种螺旋体)个种的1019株(细菌886、支原体64、螺旋体69)病原菌的肽质量参考谱,属、种识别能力分别提高了28.2%、42.3%。特异性研究揭示了基于PMF技术在属、种水平上可能错误识别的菌株,共涉及8个属、25个种的病原菌；地域性分析指出10个具有地域性特征的病原。为PMF在临床感染诊断、传染病预防控制、食品安全、口岸质检等领域的应用提供了技术基础。针对PMF分型与溯源,本研究选用高自然变异性的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)、基因组最小、分型简单的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)以及16S rRNA核糖体分型的钩端螺旋体(Leptospira)作为模式菌进行基于PMF的分型研究,探索创建种更为快速、实用的分型技术。进而,将PMF技术用于化脓性链球菌(streptococcus pyogenes, group A Streptococcus,GAS)引起的猩红热疫情爆发的流行病学实战分析。本研究采用PMF技术将HP分为P1、P2两个型别,确定了9个HP型别相关的特征肽。非标定量分析共发现30个型别相关的差异蛋白,生物信息学分析显示P1、P2型HP自身蛋白水平在趋化性、离子调控、双组分系统、分泌系统、代谢系统都有显著的不同,势必影响信号转导通路,其作用将影响宿主细胞的增殖或凋亡而导致不同的病理趋势,为后续的PMF型别作用的分子机制及与疾病的相关性研究提供了基础。针对肺炎支原体,本研究构建了遗传算法(GA)数学模型区分1型和2型MP,其结果与p1基因分型完全一致。模型的敏感度、特异性均为100%。确定了7个具有型别区分能力的特征肽,提供了一系列用于制备MP快速分型试剂盒的生物标志蛋白,并为MP PMF分型机制的揭示提供线索。针对钩端螺旋体,采用基于PMF的MSP聚类分析将钩端螺旋体按其致病性归为两大类,与16S rRNA参考方法分型结果完全一致。通过提取致病性、非致病性菌株的共性特征谱,本研究在Biotyper中引入了超级谱的概念,其致病性区分特异性为100%。采用Label-free技术共发现108个致病性相关的差异表达蛋白。在前期研究的基础上,本研究将PMF技术用于2011年猩红热疫情爆发。快速检测了猩红热爆发区哈尔滨、青岛、济南的298例猩红热及咽峡炎病人咽拭子样本的p溶血分离株,准确地从157个疑似菌株中识别了127株GAS。PMF的测试周期比传统的杆菌肽(BST)或API20缩短了36-48小时,识别能力提高5.5%。菌株匹配参考谱的emm型别分布提示本次猩红热爆发主要由emm12型GAS引起的,与后续emm分型研究结果完全一致。因此,快速、准确、自动化高通量的模式,使PMF完全可以取代传统的GAS分子分型方法,用于猩红热的临床诊断和疫情监测。针对新发病原与人工改造微生物的检测,本研究将PMF技术用于克隆表达重组菌的识别,建立一种克隆表达过程中各阶段表达体的快速分类识别方法。通过构建四维分类数学模型,将克隆表达过程的重组病原分阶段识别。最优GA模型的交叉验证及识别能力评价分别为98.7%、100%,数据验证的准确率为95%。采用表达鼠疫蛋白的重组子构建的分类模型对空肠弯曲菌、幽门螺杆菌的重组子具有同样的分类识别能力,是一种通用的模型。针对体液中病原检测的现状,本研究以布鲁氏菌菌血样本为例,采用PMF构建了布鲁氏菌特征肽质量指纹谱模型,确定了8个特征指纹肽。用该模型检测32例疑似临床病人的菌血,10例为布鲁氏菌阳性,与Tb噬菌体特异裂解实验结果一致。本研究所构建的病原肽质量谱数据库成功用于我国第一套具有独立知识产权的PMF微生物识别软件——微生物检测系统(简称MicroID系统或微检系统)(version1.0)的研发和应用。总之,本研究进行PMF技术条件的标准化、批量构建病原微生物参考谱并进行系统分析,并将构建的数据库成功用于我国第一套具有独立知识产权的PMF微生物识别系统。探索了基于PMF的病原微生物分型方法,并将PMF技术用于实际疫情爆发处理中,为PMF技术在公共卫生领域的使用提供了方法、理论依据和范例。同时创造性地将PMF技术用于重组病原的识别、体液中病原体的快速检测,构建了切实可行的方法。