一、文献综述本章主要阐述慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)的定义、分期及危害,总结了CKD患者体内大量堆积的肠源尿毒素与CKD进展之间的关系;总结了多种肠源尿毒素来源、体内合成过程以及在体内堆积对机体的危害;分析了肠源尿毒素与肠道菌群之间的关系;整理了多种干预肠源尿毒素生成、转运及排泄的治疗方法;总结了黄葵四物方(在临床治疗CKD的一线药物黄葵胶囊的基础上优化而得)治疗CKD的研究现状,为后期探究黄葵四物方对肠源尿毒素体内生成和转运的影响提供了理论基础。二、黄葵四物方对肠道菌群介导的尿毒素代谢通路的调控作用及机制研究黄葵四物方是由黄蜀葵花、黄芪、虎杖和姜黄四味中药配伍而成。本课题组前期研究发现,黄葵四物方可显著减轻CKD模型大鼠肾脏炎症细胞浸润、减少肾小球基底膜沉积、降低肾纤维化的程度;可显著抑制CKD模型大鼠血浆、肝脏和肾脏中尿毒素分子硫酸对甲酚的堆积,显著抑制肠道中对甲酚的合成,提示黄葵四物方保护CKD的作用可能与其抑制肠道菌群中对甲酚合成,减轻体内硫酸对甲酚堆积相关。为了探讨黄葵四物方对模型动物肠道菌群结构的调控作用,本章基于整体动物水平及体外肠道细菌厌氧培养,研究黄葵四物方对模型动物肠道菌群结构的调控作用,进一步观察黄葵四物方对肠道细菌合成对甲酚的影响。结果发现,黄葵四物方灌胃给药8周对CKD大鼠肠道菌群具有一定程度的调节作用,但是未表现出显著差异,提示黄葵四物方并不是通过直接抑制细菌的丰度来降低对甲酚含量的,可能与其抑制肠道菌群中对甲酚的合成途径有关。在肠道中,肠道菌群代谢食物来源的酪氨酸从而生成对甲酚。为了明确黄葵四物方对肠道菌群合成对甲酚的影响,我们建立了体外肠道细菌厌氧培养体系以及检测代谢产物对甲酚的分析方法。由于HPLC-FLD几乎不能检测出正常肠道细菌生成的对甲酚,因此,在厌氧培养中加入底物酪氨酸来促进肠道菌合成大量对甲酚。在此基础上,加入黄葵四物方,结果发现黄葵四物方可显著抑制肠道细菌生成对甲酚,其抑制能力存在剂量依赖关系。为了进一步探究黄葵四物方抑制肠道菌群合成对甲酚的作用机制,我们通过文献研究补充和完善了肠道菌群代谢酪氨酸并生成对甲酚的途径。具体为:酪氨酸被肠道细菌分解生成对羟基苯丙酮酸(p-hydroxyphenylketonic acid,HPPA)后分别进入氧化途径和还原途径。在氧化途径中,HPPA被转化成对经基苯乙酸(p-hydroxyphenylacetate,PHA),PHA进一步被代谢成对甲酚;在还原途径中,HPPA被代谢成对羟基苯乳酸(p-hydroxyphenyllactic acid,PPA)及对羟基苯丙酸(p-hydroxyphenylpropionic acid,PHPA)。基于这一代谢途径,我们将酪氨酸及其初级代谢产物HPPA与肠道细菌共培养,结果发现,黄葵四物方可促使酪氨酸代谢过程中氧化途径向还原途径转化,导致氧化途径中对甲酚的生成显著减少。接下来,将氧化途径中对甲酚的前体PHA与肠道细菌共培养发现,黄葵四物方对生成对甲酚的氧化途径还具有直接的抑制作用,直接抑制对羟基苯乙酸分解生成对甲酚。为了明确黄葵四物方抑制肠道细菌合成对甲酚的作用主要是由组方中的哪些组分贡献的,我们将方中四单药总提液与肠道细菌共培养,结果发现,四单药总提液对于肠道细菌合成对甲酚均有抑制作用。单药总提液是由单药的醇溶性部位和水溶性部位组成。因此,我们进一步研究了各单药醇溶性部位和水溶性部位对肠道细菌生成对甲酚的影响。为了研究各单药醇溶性部位对肠道细菌生成对甲酚的影响,将各单药醇提液与肠道细菌共培养,结果发现方中黄葵、虎杖和姜黄三味单药的醇溶性部位可显著抑制肠道细菌合成对甲酚。为了确认具体是黄葵、虎杖和姜黄醇溶液中哪些成分起了抑制对甲酚生成的作用,我们将黄葵四物方中8种主要的醇溶性化合物与肠道细菌共培养,结果发现,异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素、姜黄素、大黄素、虎杖苷和白藜芦醇可抑制肠道细菌代谢PHA,从而抑制对甲酚的生成。对羟基苯乙酸脱羧酶是肠道细菌代谢PHA生成对甲酚的关键酶,因此,我们通过分子对接技术进一步发现异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素、姜黄素、大黄素、虎杖苷和白藜芦醇与对羟基苯乙酸脱羧酶的结合力强,可作为该酶的抑制剂。在单药水溶性部位的研究中发现,中药水溶性部位的主要成分为多糖,且中药多糖对肠道和肾脏疾病有调节和保护的作用,因此,重点研究了各单药水溶性多糖对肠道细菌合成对甲酚的影响,结果发现,黄芪和虎杖多糖可显著抑制对甲酚的生成,其中黄芪多糖的抑制率接近100%。考虑到单药多糖对于肠道细菌生成对甲酚的抑制作用极为显著,且黄芪为药食两用型中药,因此我们提出是否食物来源的多糖也可抑制对甲酚的生成,并选取了食物来源的低聚果糖(Fructo-oligosaccharide,FOS)用于接下来的实验研究。结果显示,FOS可显著抑制肠道细菌合成对甲酚。此外,我们发现FOS可以通过调节肠道微生物介导的芳香氨基酸代谢的多种途径来减少对甲酚的产生。具体为:1、FOS显著促进酪氨酸代谢从氧化途径向还原途径的转化;2、FOS通过促进肠道细菌的增殖来促进酪氨酸用于合成细菌自身蛋白质;3、FOS可阻断氧化途径中PHA向对甲酚的转化,从而抑制对甲酚的生成。三、黄葵四物方对宿主细胞介导的尿毒素代谢通路的调控作用及机制研究前述研究发现黄葵四物方可干预PCS合成环节中肠道细菌介导的对甲酚合成过程,本章在此基础上观察黄葵四物方对宿主细胞介导的PCS合成环节及向肾脏细胞内转化环节的影响。通过UPLC-TQ/MS检测发现,黄葵四物方可显著抑制肝脏内PCS的堆积,对血浆和肾脏内PCS含量也存在一定的降低趋势,表明黄葵四物方可干预宿主细胞内尿毒素分子PCS的蓄积。为了明确黄葵四物方对PCS的合成环节中对甲酚向PCS转化的影响,黄葵四物方灌胃给予小鼠28天,在最后一天向小鼠灌胃PCS的前体分子对甲酚,检测体内PCS水平,反映黄葵四物方对于对甲酚向PCS转化环节的影响。利用UPLC-TQ/MS检测小鼠血浆、结肠及肝脏中PCS含量,结果发现黄葵四物方可显著抑制小鼠血浆中PCS的含量,对肝脏中PCS的含量存在抑制趋势,但是不影响肠道中PCS的水平。在进一步检测结肠和肝脏内磺基转移酶的酶活力及蛋白含量时发现,黄葵四物方不影响肠道中磺基转移酶的含量;不影响肝脏内磺基转移酶的酶活力;但是黄葵四物方可显著抑制肝脏内磺基转移酶的基因转录和蛋白水平的表达。以上结果说明,黄葵四物方可显著抑制肝脏内磺基转移酶的表达,从而抑制对甲酚向PCS转化,并最终抑制体内PCS的生成。为了明确黄葵四物方对PCS经由肾脏转运体(organic anion transporter,OAT1/3)向肾脏细胞内转运环节的影响,将PCS腹腔注射给予小鼠,使用UPLC-TQ/MS检测小鼠血浆和肾脏内PCS含量,反映黄葵四物方对PCS向肾脏转运过程的影响。结果发现,黄葵四物方不影响小鼠体内血浆和肾脏中PCS含量。我们在正常大鼠体内进行了再次验证,结果发现,黄葵四物方同样不影响大鼠血浆和肾脏内PCS的含量,且不影响肾脏内OAT1/3的表达水平。在腺嗓呤模型大鼠体内同样发现黄葵四物方不影响模型大鼠肾脏内OAT1/3的表达水平。以上结果说明,黄葵四物方不影响大鼠OAT1/3基因和蛋白表达,也不影响PCS转运进入肾脏过程。提示我们黄葵四物方抑制PCS在肾脏中的蓄积并不是通过影响PCS向肾脏内的转运环节来实现的。以上研究表明黄葵四物方可通过调控肠道菌群介导的对甲酚代谢通路及干预肝脏内特异性代谢酶的表达来减少体内PCS蓄积。