论文部分内容阅读
脂质是羊乳中重要营养成分之一,其含量与组成决定了羊奶的特殊风味与营养价值。乳腺上皮细胞是乳脂合成的主要场所。五羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）又名血清素（Serotonin）,是一种单胺类化合物。5-HT受体（Serotonin receptors,HTRs）介导了5-HT在中枢神经系统及外周系统中丰富的调控功能。5-HT已被报道参与肝脏、脂肪组织中的脂质代谢。在乳腺中,5-HT具有调节腺泡发育、调控乳蛋白合成、维持钙代谢稳态等功能,山羊乳腺上皮细胞（Goat mammary epithelial cell,GMEC）能够通过细胞膜上的HTRs感知并响应机体对乳腺的功能调控。本团队前期通过构建竞争性内源RNA（Ce RNA）调控网络,发现5-HT参与调控泌乳初期奶山羊体循环钙代谢、脂质代谢、免疫反应等生物学过程。但目前关于5-HT对山羊乳腺脂质代谢的调控作用尚未见报道。而阐明5-HT对山羊乳腺上皮细胞脂质代谢的影响及分子机理,对调控羊奶脂质含量与组成、促进山羊乳腺生理健康、提高羊奶品质等具有重要意义和价值。本研究通过分析奶山羊体内5-HT水平与乳脂含量及乳脂肪酸组成的相关关系,构建5-HT处理体外培养乳腺上皮细胞模型,检测GMEC中脂质含量、脂质合成相关基因表达与蛋白表达,依据生物信息学分析结果验证细胞间信号转导途径与蛋白间互作效应,明确了5-HT对GMEC脂质合成的调控作用,筛选并阐明了5-HT调控山羊乳腺脂质合成的关键受体及其分子机制。具体研究结果如下:1.泌乳初期奶山羊体循环中5-HT与乳成分、乳脂肪酸组成间相关性分析采集了30只产后第7d的奶山羊血液及乳汁样品,对样品中5-HT浓度、钙浓度、PTHr P浓度、乳成分组成及乳脂肪酸组成间进行了相关性分析。发现:奶山羊血清5-HT浓度与乳中5-HT浓度（R=0.431,P＜0.05）、乳中钙浓度（R=0.442,P＜0.05）、乳中PTHr P浓度（R=0.421,P＜0.05）间均呈正相关关系;乳中5-HT浓度与乳中钙浓度间呈正相关关系（R=0.442,P＜0.05）;血清5-HT浓度与乳中C17:0（R=-0.438,P＜0.05）、C17:1（R=-0.497,P＜0.05）、C18:2（R=-0.516,P＜0.05）脂肪酸含量间呈负相关关系;乳中5-HT浓度与乳中C10:0（R=-0.479,P＜0.05）、C17:0（R=-0.433,P＜0.05）、C18:0（R=-0.441,P＜0.05）脂肪酸含量间呈负相关关系。推测,5-HT可能对奶山羊乳腺脂质合成具有调控作用。2.5-HT对山羊乳腺上皮细胞中脂质合成的调控作用为探究5-HT对奶山羊乳腺中脂质合成的调控作用与分子途径,构建了5-HT处理离体培养原代山羊乳腺上皮细胞模型;细胞活性实时分析结果发现,GMEC细胞活性随5-HT处理浓度（0、6.25、12.5、25、50、100、150μM）的升高而升高;CCK8试验结果表明,细胞增殖活性在5-HT处理浓度为150μM和200μM时显著升高（P＜0.05）;100μM 5-HT处理GMEC,升高了细胞中钙水平,降低了细胞中脂滴积累、甘油三酯（TAG）含量、胆固醇（TC）含量、C12:0脂肪酸和C14:0脂肪酸含量（P＜0.05）;此外,100μM 5-HT处理还下调了细胞中ACC、FASN、SREBP1、SCD1等脂质从头合成相关基因的m RNA表达,抑制了SREBP1c、p-m TOR、p-S6K蛋白表达（P＜0.05）;检测与负调控细胞脂质合成密切相关的CAMKKβ-AMPK信号通路的活性,发现5-HT处理显著促进CAMKKβ和AMPK的激活（P＜0.05）;进一步试验证实,Compound C（AMPK抑制剂）和STO-609（CAMKKβ抑制剂）能够取消5-HT对GMEC脂质合成相关指标的负调控作用。说明,5-HT通过并激活CAMKKβ-AMPK信号通路发挥对GMEC脂质合成的负调控作用。3.5-HT通过HTR2A负调控GMEC脂质合成为进一步探究5-HT负调控GMEC脂质合成功能的关键受体及其作用效果,检测了5-HT的14种受体（HTRs）在不同泌乳时期（泌乳初期、泌乳盛期、泌乳中期、泌乳末期）奶山羊乳腺组织中的表达谱,发现除HTR5B外其他13种受体在奶山羊乳腺组织均有表达,泌乳初期乳腺组织中的HTR2A表达水平显著低于其他三个泌乳时期;在GMEC中,5-HT处理显著上调HTR2A基因的m RNA表达（P＜0.05）,PCPA（5-HT合成酶抑制剂）处理GMEC显著下调HTR2A基因的m RNA表达（P＜0.05）;克隆得到奶山羊HTR2A基因CDS区DNA片段并对其进行生物学信息分析,蛋白互作网络预测结果显示山羊HTR2A蛋白与钙调蛋白（Calmodulin,CaM）、CAMKKβ、AMPK蛋白间存在蛋白互作效应;使用si RNA干扰HTR2A基因显著上调脂质合成相关基因ACC、FASN、SREBP1的表达和钙代谢相关基因PMCA1、SPCA1的表达,抑制细胞中HTR2A蛋白表达和CAMKKβ、AMPK的活性（P＜0.05）;SAR（HTR2A特异性拮抗剂）处理GMEC,显著升高了细胞脂滴积累、TAG含量、TC含量,挽救了5-HT对细胞TAG、TC含量的抑制效应（P＜0.05）;构建山羊HTR2A基因的过表达质粒载体,转染GMEC,发现HTR2A的过表达下调了脂质合成相关基因FASN、ELOVL6的m RNA表达,上调了CAMKKβ和AMPK的蛋白活性（P＜0.05）;HTR2A的过表达升高了细胞中钙离子水平,降低了细胞脂滴积累、TAG、TC含量;Compound C和STO-609能够取消过表达HTR2A对CAMKKβ-AMPK的激活作用（P＜0.05）。说明,5-HT是通过HTR2A激活CAMKKβ-AMPK信号通路发挥对GMEC脂质合成的负调控作用,靶向HTR2A的si RNA或特异性拮抗剂能够促进GMEC中脂质合成。4.GMEC中HTR2A蛋白与CaM蛋白间相互作用研究为进一步探究HTR2A与其介导5-HT对GMEC脂质合成负调控功能的效应调节蛋白及其分子作用机制,克隆得到奶山羊CaM基因CDS区DNA片段;CaM靶标数据库软件分析预测结果显示,在山羊HTR2A蛋白上存在2个CaM蛋白结合域,分别位于第185～200位氨基酸处和第377～393位氨基酸处,结合域内S188和S391位点磷酸化活性显著;构建了用于双分子荧光互补试验的质粒载体p-Bi FC-VN155-HTR2A和p-Bi FC-VC155-CaM,共同转染GMEC后检测到荧光表达,表明山羊HTR2A蛋白与CaM蛋白间存在互作效应;构建了用于免疫共沉淀试验（Co-IP）的标签蛋白融合表达载体p EF-Neo-Flag-HTR2A和p EF-Neo-Myc-CaM并共转染GMEC,结果同样表明两种蛋白间存在互作效应;利用分段克隆与融合PCR等方法构建了将HTR2A上CaM结合域S188和S391位点丝氨酸（S）突变为谷氨酸（E）的（模拟HTR2A持续磷酸化激活）标签蛋白融合表达载体p EF-Neo-Flag-HTR2A-S188E和p EF-Neo-Flag-HTR2A-S391E,分别与p EF-Neo-Myc-CaM载体共同转染GMEC,Co-IP结果发现山羊HTR2A蛋白S188E和S391E位点突变后HTR2A蛋白与CaM蛋白间互作较未突变时降低（P＜0.05）;使用EGTA将细胞中钙螯合后,5-HT无法发挥对GMEC脂质合成的负调控作用。说明,山羊HTR2A与CaM蛋白间存在互作效应,HTR2A上CaM结合域中S188、S391位点是调控互作效应的关键受体激活位点;细胞中钙离子参与了5-HT对GMEC脂质合成的负调控作用。综上,本研究首先发现了产后第7d奶山羊体循环中5-HT浓度与乳脂肪酸含量存在负相关关系,进而以离体培养的山羊乳腺上皮细胞为研究对象,揭示了5-HT通过HTR2A,激活CAMKKβ-AMPK信号通路负向调控山羊乳腺上皮细胞脂质合成的作用及分子机制,并确定HTR2A与CaM蛋白间存在相互作用,且HTR2A蛋白上的S188与S391位点是关键受体激活位点。本研究结果为阐明5-HT对山羊乳腺上皮细胞脂质代谢的分子调控机理积累了资料。