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α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC3.2.1.20，简称AGL），在化学本质上是一种糖蛋白，能够催化低聚糖和其他类似物非还原端的α-1,4糖苷键断裂，释放出葡萄糖，在自然界中广泛存在，其中来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的α-葡萄糖苷酶具有热稳定性好，pH稳定范围广，转苷能力强等特性，这些特性决定了它在工业化生产低聚异麦芽糖（IMOs）具有巨大的应用价值。本实验室前期研究通过RT-PCR以A. niger CICIM F0620的总RNA为模板扩增得到α-葡萄糖苷酶cDNA并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达，3L发酵罐放大培养后酶活达到3.51U/mL。本研究对前期构建的重组P. pastoris KM71/pPIC9K-aglu生产α-葡萄糖苷酶的3L罐发酵工艺进行了优化，共表达了P. pastoris二硫键异构酶（PDI），同时对黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因进行了全面分析并针对毕赤酵母作为宿主菌对其进行了密码子优化，主要结果如下：（1）为了提高α-葡萄糖苷酶在重组P. pastoris中的表达量，在3L罐上对其发酵工艺条件进行了优化。结果表明：初始诱导菌浓，诱导温度，诱导pH以及诱导阶段维持甲醇浓度对α-葡萄糖苷酶表达量都有不同程度的影响，且初始诱导菌浓对酶活影响最大。当初始诱导菌浓为115.2g/L，诱导温度26℃，诱导pH为5.5，诱导阶段维持甲醇浓度1%时，酶活最高达到5.5U/ml，是优化前的1.58倍，蛋白浓度也从之前的1.59mg/ml上升到2.47mg/ml（2）黑曲霉α-葡萄糖苷酶含有三对二硫键，为了优化P. pastoris表达重组酶时的折叠环境，以提取的酵母基因组为模板通过PCR获得P. pastoris二硫键异构酶基因并克隆到P. pastoris表达载体pPICZ A，线性化后转入P. pastoris KM71/pPIC9K-aglu，得到重组菌P. pastoris KM71/pPIC9K-aglu/pPICZ A-pdi进行摇瓶和3L罐培养，结果显示共表达菌株酶活未提高反而有下降趋势，同时发现3L罐上重组菌的生长受到明显抑制，推测是在毕赤酵母强启动子下过量表达PDI诱导了内质网未折叠蛋白质反应（UPR），引起了细胞凋亡和内质网相关性降解（ERAD）从而影响了α-葡萄糖苷酶在P. pastoris的表达。（3）对来源于A. niger CICIM F0620的α-葡萄糖苷酶基因针对毕赤酵母作为宿主进行了密码子优化，人工合成后的基因克隆到P. pastoris表达载体pPIC9K上，线性化后转入P. pastoris菌株KM71，获得重组菌株KM71/pPIC9K-agluOP，采用优化后的发酵条件在3L发酵罐中诱导110h后，酶活达到最大为10.1U/ml，较密码子优化前提高了86.4%，蛋白浓度达到5.23mg/mL。