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前言 创伤是广泛危害人类的“发达社会疾病”,深入研究创伤后的组织修复问题仍然是医学领域的重点和难点。创伤修复是体内多种因子和细胞参与的复杂过程。外源性生长因子对创伤修复的作用已成为当今创伤修复学研究的热点。成纤维细胞生长因子(FGF),尤其是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)具有广泛的生物学活性,是伤口愈合过程中所有相关细胞的促有丝分裂原、化学趋化及调节蛋白,可影响创伤修复的整个过程。bFGF调控创伤愈合的机制精细而复杂,深入了解其促创伤修复机制,对指导临床合理有效地应用bFGF具有重要意义,然而这方面的研究目前报导甚少。 本实验通过研究bFGF诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖中,核转录因子κB(NF-κB)和细胞周期相关蛋白ki-67的表达,及bFGF对血管生成抑制剂TNP-470和糖皮质激素地塞米松(Dex)作用的影响,来阐述bFGF促进内皮细胞(EC)增生的可能机制,为进一步研究FGF促进肉芽组织增生、创伤修复的作用机制提供实验依据。 方法 首先采用改进的Jaffe法进行HUVEC培养。待细胞达亚融合状态后,换无血清培养液使其停止生长。施加实验因素,分成6组:正常对照组(无血清DMEM);bFGF组(500ng/ml);Dex组(0.1μM);TNP-470组(10-7/ml);bFGF+Dex组;bFGF+TNP-470组。48小时后进行各项检测。采用M竹试剂(3一(4,5一二甲基唾哇一2)2,5一二甲基四氮哇澳盐)比色分析法测定EC生长活性;采用流式细胞计数仪检测EC周期各时相相对细胞数;采用免疫组化方法检测EC中NF一KB和kl一67的表达;实验结果采用SPSS软件包进行数据统计分析和处理。结果 M竹检测结果,与对照组相比,bFGF显著刺激EC增生,使细胞数增加(P<0.05);bFG.F可减轻Dex和TNP一470对EC增生的抑制作用(P<0 .05)。流式细胞仪分析结果,bFGF使Go/Gl期EC比例减少,S期和几/M期比例增加,PI值增大(P<0.05);TNP-470使G0/G:期Ec比例上升,s期和几/M期比例下降,PI值降低(P<0.05);且bFGF可阻断TNP一470对EC增生的抑制,使PI值接近正常(P<0.05)。免疫组化结果显示,正常对照组,ki一67在核内极少表达,NF一姗丙5蛋白棕褐色染色多位于胞浆;bFGF组,胞核内ki一67和NF一KB两5蛋白表达均增加,可见棕褐色点状分布的颗粒,与对照组相比,差异显著(P<0.01);Dex和TNp-470使胞核染色明显变浅,阳性细胞数目显著减少,阳性率降低(TNP一470组,P<0.05);bFGF可逆转此抑制效应。讨论 外用FGF促进创面愈合已被许多实验所证实,但尚不清楚其作用的相关机制。本实验验证了bFGF对培养的HUVEC增生的调控作用。MTT分析结果可见,bFGF刺激EC增生,使细胞数增加。h一67是一种细胞增殖核抗原,除G0期外,细胞周期所有活性阶段均有表达。本实验应用鼠抗人匕一67单克隆抗体检测bF.GF对细胞周期的影响,结果显示,bFGF可促进EC核内ki一67的表达,刺激EC由静止期进人增殖期,加速细胞周期进程。流式细胞仪检测结果显示,bFGF使G碑q期EC比例减少,S期+GZ/M期比例增加。以上均表明bFGF有显著促进EC增生的作用,是EC增生的有力刺激剂。 本研究进一步探讨bFGF促EC分裂作用的机制。细胞外的bFGF与其细胞膜上两种相关受体(HSPG和bFGFR)形成复合物,通过一系列信号级联传导途径将信号传至细胞核。核转录因子NF一KB为一重要的调节因子,静息状态下,与其抑制蛋白IK一B偶联,以无活性形式驻留在胞质内。受刺激活化后,IK一B被降解,NF一KB则从胞浆移位人胞核发挥其调控功能。本实验应用兔抗人NF一KB两5多克隆抗体检测EC内NF一KB的活化,结果表明,bFGF可活化NF一KB,使其在核内表达增加。由此推测,bF-GF显著促进EC增生的可能机制是通过 NF一KB活化,从而促进DNA合成、细胞分裂增生。 TNP一470可抑制EC生长和迁移,为特异性血管生成抑制剂。本实验表明,,rNP一470单独作用使细胞数减少,核内ki一67表达减少,NF一KB表达明显降低,PI值下降;而bFGF可减轻此抑制作用。 Dex是一种非特异性NF一KB阻断剂,可诱导IK一B的合成,阻止NF一KB释放,从而抑制依赖NF一KB的转录。本实验显示,Dex对未受刺激的EC增生无显著影响,可使核内kl一67表达减少,NF一KB表达明显降低;加人bFGF使其抑制增生作用逆转。结论 1.bFGF使体外培养的EC数目增加,ki一67表达增强,PI值增大,显著促进EC增生。 2.bFGF促EC增生的可能机制是通过活化NF一KB,使细胞由静止期进人增殖期,促进DNA合成、细胞分裂增殖。 3.TNP一470使细胞数减少,h一67与NF一KB表达降低,PI值下降,抑制EC分裂与增殖;bFGF可逆转其抑制效应。 4.Dex对未受刺激的EC增生无显著影响,可抑制ki一67与NF一KB表达;bFGF使其作用逆转。