研究背景阿尔茨海默病(AD)是老年人群中最常见的痴呆类型,是一种损害患者认知及记忆功能为主要特征的痴呆。目前全球大约有5千万的人患有AD及其相关疾病,随着人类评价寿命的延长,估计到2030年这一数据将增长为8千万,2050年则将达到1.6个亿。随着我国人口老龄化的加剧,AD患病率逐年上升,据统计,我国老年人群AD患病人口已经超600万,预计到2050年患病人口将超过2千万,是世界上AD患病人口最多、增长速度最快的地区,给患者、家庭、社会和医疗带来沉重负担。AD病因和发病机制复杂,目前尚不完全清楚。在AD的治疗方面,尚缺乏有效的根治手段,目前主要是对症处理。因此深入研究AD的病因和发病机制,并依此寻求有效的防治措施是目前亟需解决的重大问题。β淀粉样蛋白(amyloid β,Aβ)在脑组织中的沉积和过度聚集是AD发病的主要病因及病理改变。但目前AD发病的具体机制尚不明确,目前较为公认的机制包括:Aβ级联反应学说、Tau蛋白学说、突触功能障碍、自噬功能障碍、线粒体功能障碍,包括线粒体功能障碍、线粒体自噬障碍、线粒体动力学障碍等。研究发现,遗传和表观遗传学都参与了 AD的发病。m6A甲基化是真核生物RNAs中最丰富的修饰,占RNA碱基甲基化的80%以上,存在于多种物种中。随着科学技术的进步,现已发现甲基转移酶的复合物包括METTL3(methyltransferase-like protein 3)、METTL14(methyltransferase-like protein 14)、Wilms tumorel结合蛋白(WTAP)等。去甲基酶主要包括:脂肪质量和肥胖相关蛋白(obesity-associated protein,FTO),它是第一个被发现催化m6A去甲基化的蛋白,去甲基酶还有FTO自身的同源物ALKBH5(AlkB homologue 5)。此外,YT521-B 同源性(YTH)结构家族包括 YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和异质核核糖核蛋白A2B1(HNRNPA2B1)均被证明是m6A甲基化结合蛋白,它们通过影响mRNA的稳定性、输出、翻译、剪接和衰变而发挥调节作用。近年的一些研究表明,RNA甲基化的失调与许多生物学及病理过程有关,其中包括神经发育和神经退行性疾病。然而,RNA m6A甲基化是否参与了 AD的发病,又是通过何种机制参与调控的?是否影响了突触功能进而调控AD的发病?还是通过影响了线粒体的自噬途径?因此,在本研究中,研究了 RNA m6A甲基化在AD模型及对照组中的差异化表达,对甲基酶在AD模型中的表达情况进行探讨;同时,使用慢病毒介导的RNA干扰转染技术,检测了 AD细胞模型中METTL3 RNA干扰后,相关基因表达量的情况,线粒体自噬相关蛋白的变化以及透射电镜下线粒体超微结构的改变,从而推测RNA m6A甲基化在AD中可能的作用机制。同时,初步观察了环状RNA(circle RNAs,circRNAs)在AD发病中的可能作用。第一部分mRNA N6-甲基腺嘌呤通过调控突触功能参与阿尔茨海默病发病的研究目的结合上述背景,本研究使用经典的APP/PS1双转基因小鼠作为AD动物模型,以Aβ25-35处理24小时的SH-SY5Y细胞作为AD细胞模型,研究的主要内容包括:1、通过高通量测序观察在AD动物模型及对照组中的mRNA m6A甲基化表达谱。2、观察甲基化修饰酶在两组小鼠不同脑组织中的表达情况。3.检测发生mRNA m6A甲基化差异表达的基因中,与突触功能相关的基因表达量。探讨AD发病是否有mRNA m6A甲基化的参与,以及mRNA m6A甲基化参与AD发病的可能机制,为寻找AD的治疗靶点提供新的思路与方向。实验材料与方法1.动物组织:以9月龄APP/PS1雄性小鼠作为AD动物模型,为实验组,C57BL/6同月龄雄性小鼠作为对照组。每组小鼠为15只。2.细胞模型,SH-SY5Y细胞系作为对照组,A β 25-35处理24小时的SH-SY5Y(Aβ-SY5Y)细胞作为AD细胞模型,在37℃C,5%CO2孵箱条件下,常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。3.mRNA m6A甲基化测序。采用9月龄APP/PS1小鼠及同月龄C57BL/6对照小鼠的海马组织进行mRNA m6A甲基化高通量测序,每组小鼠各3只。4.mRNA m6A甲基化水平定量检测。此部分使用动物组织来检测:采用AD小鼠模型组及对照组小鼠脑组织,各分为皮层、海马以及小脑3部分组织,分别提取出各部位的RNA,使用mRNA m6A甲基化定量试剂盒完成。5.检测AD动物模型组及对照组中甲基转移酶METTL3及去甲基酶FTO的表达。分别提取两组小鼠的海马、皮层及小脑三部分的组织蛋白,采用Western Blot的方法进行验证。6.根据高通量测序结果,筛选出甲基化差异表达的与突触功能相关的3个基因,其中两个基因在AD动物模型中mRNA m6A甲基化水平上调,另一基因在AD模型中mRNA m6A甲基化水平下调,取小鼠海马组织采用qRT-PCR的方法来验证其基因表达量。实验结果1.高通量测序结果表明,AD模型组小鼠较对照组小鼠海马组织中,存在大量mRNA m6A甲基化差异表达的基因,许多基因涉及突触功能。2.mRNA m6A甲基化水平定量结果:AD动物模型组小鼠较对照组小鼠,皮层及海马区mRNA m6A甲基化水平定量升高,在小脑区mRNA m6A甲基化水平无统计学差异。3.甲基酶在两组小鼠脑组织中的表达情况:甲基转移酶METTL3在皮层及海马区的蛋白表达量在AD模型组较对照组中升高,有统计学差异,而在小脑中的蛋白表达无统计学差异;去甲基酶FTO在AD模型较对照小鼠的海马区的蛋白表达量较对照组下降,有统计学差异,而在皮层和小脑中其蛋白表达量无统计学差异。4.Gene ontology(GO)分析及 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析显示,mRNA m6A甲基化差异表达的mRNAs与树突发育、转运、细胞成分与过程的正向调节、细胞成分的组织或生物发生、神经系统发育等过程以及与特定物质(如蛋白质、酶、金属离子、阳离子和杂环化合物)的结合以及催化活性有关。KEGG通路分析预测了 AD脑组织mRNAs m6A甲基化的变化所影响的通路,其中包括与突触、谷氨酸能突触、轴突引导、长时程增强和钙信号途径等有关。5.筛选出的3个与突触功能相关的甲基化差异表达的基因,他们的基因表达量在两组小鼠中有统计学差异,其中AMPA和NMDA两个基因在AD动物模型组中mRNA m6A甲基化水平下调,而他们的基因表达量在AD动物模型组中升高,SEMA基因则与上述两个基因的表达量呈相反趋势。结论1.AD模型小鼠较对照组存在大量mRNA m6A甲基化差异表达的基因,我们推测mRNA m6A甲基化可能在AD发病中起重要作用。2.我们推测mRNA m6A甲基化作为一种重要的表观遗传学调控模式,可能通过调控突触功能而参与了 AD的发病,但这需要进一步研究证实。第二部分mRNA m6A通过影响自噬功能参与阿尔茨海默病发病的研究目的结合上述研究背景,研究慢病毒介导的METTL3 RNA干扰后mRNA m6A甲基化差异表达基因的基因表达量的改变,同时检测METTL3 RNA干扰后AD细胞模型及对照组中线粒体自噬相关蛋白、线粒体超微结构的改变。进一步探讨mRNA m6A甲基化参与AD发病可能的机制。实验材料与方法1.细胞培养:同第一部分。2.采用mRNA m6A甲基化水平定量试剂盒检测AD细胞模型及对照组中mRNA m6A甲基化水平。3.采用Western Blot来进行甲基转移酶METTL3及去甲基酶FTO在两组细胞中的蛋白表达量的检测。4.慢病毒介导的METTL3 RNA干扰载体的构建:上海吉凯公司协助慢病毒载体的构建及包装工作。共提供3个引物作用靶点。5.分别使用3个慢病毒载体转染SH-SY5Y细胞系,并设立空白对照组。72小时后,用荧光显微镜观察慢病毒转染率;同时利用qRT-PCR方法进一步验证慢病毒载体的转染效率。从中选择转染效率高的靶点备用。6.细胞分组:筛选出稳定转染珠后,此时细胞分为SH-SY5Y组、慢病毒空载体组以及METTL3 RNA干扰组,然后使用Aβ25-35分别处理上述细胞24小时,此时细胞共分为4组,SH-SY5Y组,Aβ-SY5Y组,Aβ-空载体组,Aβ-METTL3--SY5Y 组(即 METTL3 RNA 干扰的 AD 细胞模型)。7.通过qRT-PCR的方法验证mRNA m6A甲基化差异表达的与自噬功能相关基因的表达量。共筛选出4个基因(MAPK、Mtor、PI3K、CDC42)来进行检测。8.线粒体自噬相关蛋白表达量的检测:提取上述细胞的蛋白,通过Western Blot进行线粒体自噬相关蛋白Parkin的表达检测。9.透射电镜观察线粒体超微结构的变化。使用透射电镜分别观察上述四种细胞的线粒体超微结构。实验结果1.mRNA m6A甲基化水平定量检测结果显示,AD细胞模型组较对照组mRNA m6A甲基化水平升高,存在统计学差异。2.Western Blot检测甲基酶蛋白表达量的结果显示,甲基转移酶METTL3在AD细胞模型组较对照组中蛋白表达量升高,而去甲基酶FTO在两组细胞中的蛋白表达量无统计学差异。3.使用慢病毒载体介导的METTL3 RNA干扰转染细胞后,METTL3基因表达量显著下降,转染效率高。其中一个靶点使METTL3的基因表达量下降高达90%,其用于后续实验。4.细胞水平验证自噬相关的m6A甲基化差异表达基因的表达量存在统计学差异。其中,MAPK基因在AD细胞模型较对照组中基因表达量升高,而在METTL3 RNA干扰后的AD细胞模型中,该基因的表达量下降,均存在统计学差异;而Mtor和PI3K两个基因与MAPK呈相反趋势;CDC42基因在AD细胞模型较对照中基因表达量下降,而METTL3 RNA干扰的AD细胞模型和在AD细胞模型中该基因的表达量无统计学差异。5.线粒体自噬相关蛋白Parkin的表达结果显示,AD细胞模型中较对照组中该蛋白表达升高,而METTL3 RNA干扰后的AD细胞模型中的该蛋白的表达量下降,均存在统计学差异。6.线粒体的超微结构在透射电镜下表现不同。SH-SY5Y细胞的线粒体结构清晰,膜结构完整,嵴清晰可见,空载体病毒转染的细胞与SH-SY5Y细胞线粒体结构无明显差异,AD细胞模型中的线粒体则体积大、肿胀,结构不完整,嵴不清晰,同时可见许多损伤、退化和片段化的线粒体,而METTL3 RNA干扰后的AD模型细胞中大多线粒体结构清晰、完整。结论1.AD细胞模型较对照组中mRNA m6A甲基化水平升高,甲基转移酶METTL3在两组细胞中的蛋白表达量不同,mRNA m6A甲基化差异表达与自噬功能相关的一些基因在各组细胞中的表达量不同,经METTL3 RNA干扰后的AD细胞模型中线粒体结构发生了变化,以上结果提示着mRNA m6A甲基化可能参与了 AD的发病。2.mRNA m6A甲基化可能通过影响了自噬功能而参与了 AD的发病。第三部分ci rcRNAs N6-甲基腺嘌呤参与阿尔茨海默病发病的初步研究目的1.研究AD动物模型组及对照组中circRNAs m6A甲基化谱,从甲基化差异表达的基因中筛选出数个基因检测基因表达量的改变,探讨circRNAs m6A甲基化是否可能参与了 AD的发病。2.探讨circRNAs可能通过何种机制参与AD的发病。实验材料与方法1.动物组织:以9月龄APP/PS1雄性小鼠作为AD动物模型,C57BL/6同月龄雄性小鼠作为对照组。每组小鼠为10只。2.circRNAs m6A甲基化测序。采用9月龄APP/PS1小鼠及同月龄C57BL/6对照小鼠的海马组织进行circRNAs m6A甲基化高通量测序,每组小鼠各3只。3.根据高通量测序结果,筛选出甲基化差异表达的与自噬功能相关的5个基因,采用qRT-PCR的方法来验证其基因表达量。实验结果1.AD模型组小鼠海马区较对照组小鼠海马区,存在大量甲基化差异表达的circRNAs,并且许多基因涉及自噬功能。2.两组小鼠中circRNAs m6A甲基化差异显著的基因在各染色体中的分布不尽相同。AD动物模型小鼠中circRNAs m6A甲基化差异的基因在各染色体上均有分布,其中含有甲基化上调基因多的前五位的染色体有1、2、5、7、X染色体,含有下调基因多的前五位的染色体包括:1、2、5、6、9染色体。3.筛选出的5个与自噬功能相关甲基化差异表达的基因,部分基因表达量在两组中是有统计学差异的:PAK3基因在AD动物模型组较对照组中基因表达量下降,Erbb4基因则呈相反趋势,另外Axin2、ache、usp7三个基因在两组中小鼠中的基因表达量无统计学差异。结论1.AD模型小鼠中存在大量circRNAs m6A甲基化差异表达的基因,部分基因的基因表达量不同,提示circRNAs m6A甲基化可能参与了 AD的发病。2.cirRNAs m6A甲基化可能通过影响自噬而参与了 AD的发病。