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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是能够感染所有温血动物的机会性致病寄生虫,它寄生于机体的有核细胞内从而引发弓形虫病(Toxoplasmosis)。该寄生虫主要通过污染的食物和水感染宿主,同时也存在垂直传播,通过母婴传播的方式来感染子代,孕妇若感染弓形虫可能导致胎儿流产、畸形或者死胎等。据统计全球约三分之一的人口感染过弓形虫,并且其对畜牧业的影响也非常重大,因此在医学和兽医学上均受到广泛重视,但是目前并没有有效的药物能够根除弓形虫,因此弓形虫疫苗的研制一直是近年来研究热点之一。自然界中广泛存在的乳酸菌是构成益生菌的重要成员之一,它不仅可以抑制人和动物肠道有害菌的生长,还能调节菌群的平衡和内环境pH的稳定,使机体保持稳定的免疫状态。乳酸菌是一类具有佐剂活性的非病原菌,不产生内毒素,通过它表达的外源蛋白可直接随菌体服下,是目前较为理想的转化和表达系统,且具有广阔的应用前景。本论文对弓形虫致密颗粒蛋白4、7、20(GRA4、GRA7、GRA20)和棒状体蛋白20(ROP20)基因序列的变异做了分析。首先对不同宿主和地理来源的虫株进行PCR扩增,再进行克隆测序,然后用Clustal X 1.83进行序列比对,最后再用最大相似法(maximum likelihood,ML)、邻接法(neighbor joining,NJ)和最大简约法(maximum parsimony,MP)构建种系发育树。结果表明:在12株不同虫株当中,GRA4和GRA7的基因序列分别为966bp和712bp,其种内变异率分别为0~2.4%和0~2.7%;在16株虫株中,GRA20基因序列为1586bp,种内变异率为0~7.9%,当去掉Ⅲ型虫株(CTG、VEG)后,种内变异率为0~0.7%;在18株不同的弓形虫虫株当中,ROP20基因序列为1659bp,种内变异率为0~1.4%。通过构建种系发育树显示,GRA4基因不能较好的反应不同虫株间的遗传变异关系,GRA7基因能区分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型虫株,GRA20基因能区分Ⅰ型和Ⅲ型虫株,ROP20基因能区分弓形虫Ⅰ型和ToxoDB#9型虫株。本论文还以乳酸杆菌作为载体来探讨弓形虫GRA4和GRA7在口服免疫方式下的免疫效果。首先根据ToxoDB网站上收录GT1型虫株的GRA4和GRA7基因序列用Primers5.0设计带有酶切位点NcoⅠ和XbaⅠ的引物,并在两个蛋白的C端引入His标签。经过PCR扩增和克隆测序,得到的GRA4和GRA7序列,并将其分别连接转化至大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP-409中,由此成功构建重组表达载体pSIP-409-GRA4和pSIP-409-GRA7。将重组质粒pSIP-409-GRA4和pSIP-409-GRA7通过电转化技术转入Lb.plantarum NC8中,并进行双酶切及PCR鉴定,再用Western-blot分析,成功制备弓形虫GRA4和GRA7重组乳酸菌后,再将其免疫小鼠。首先将小鼠分为空白组、空白奶粉组和Nc8-pSIP-409乳酸杆菌空载体组三个对照组以及Nc8-409-GRA4和Nc8-409-GRA7重组乳酸杆菌组两个实验组,以口服的方式来免疫小鼠。免疫程序为每周连续口服三天,每次每只小鼠灌服1.0×109cfu/200μL,连免两周后间隔一周,再加强免疫两次。待免疫结束后,测定相应的体液免疫和细胞免疫指标,并在一免后42d,用强毒株RH速殖子(103个/只)通过腹腔接种感染小鼠,记录每组小鼠存活时间。实验结果显示:弓形虫GRA7重组乳酸菌疫苗在对小鼠口服免疫后其机体内可产生较高水平的IgG和IgG2a以及IFN-γ,并产生高水平的CD3+CD4-CD8+和CD3+CD4+CD8-T细胞,能够有效地产生Th1型免疫应答,而GRA4重组乳酸菌疫苗的免疫原性较弱。在对小鼠腹腔注射弓形虫RH速殖子后,对照组小鼠的平均存活时间为6.1d,NC8-409-GRA7组小鼠的平均存活时间延长至6.8d,但与对照组相比无显著差异,而NC8-409-GRA4组小鼠的平均存活时间与对照组相比未延长。本实验首次将弓形虫GRA4、GRA7与乳酸菌重组进行口服免疫,实验证明弓形虫GRA7重组乳酸菌疫苗具有一定的免疫原性,能对弓形虫感染产生一定的免疫保护作用,为今后研制抗弓形虫新型疫苗提供了新的思路。