糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是因胰岛素分泌紊乱、胰岛素抵抗导致的以血糖升高为特征的内分泌疾病。近年来由于生活节奏不断加快、生活方式改变,DM已经成为最为常见的代谢性疾病。据报道,截止2019年全球范围内DM的确诊人数已经超过4.5亿,且该病的患病人数仍在不断攀升,预计到2045年糖尿病的影响范围将达到7.2亿人次。据目前的统计显示,DM已经位列全球七大致死性疾病之一。糖尿病的危害在于长期高糖及血糖波动导致的多器官功能损害,其多种类型并发症不但大大降低了患者的生活质量,同时也大大提高了该病的致残率、致死率。近来,随着对糖尿病危害性认识的深入,由糖尿病导致的心血管疾病、视网膜病变、肾病都引起了广泛的关注。但对糖尿病骨质疏松症这一类“隐匿性”并发症的研究仍较为薄弱。骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是由诸多病因导致代谢异常引起的全身性骨疾病,其基本特征为骨小梁受损、骨微结构紊乱导致的骨密度降低、骨脆性增加。既往的观点将糖尿病和骨质疏松症视为两种单独存在、彼此独立的疾病,但其实两者密切相关。早在上个世纪三十年代,Morrison等人就发现随着患糖尿病时间的延长,儿童骨骼生长会越来越迟缓,甚至造成骨萎缩的发生。而直到20年之后,“糖尿病性骨质疏松”（Diabetic osteoporosis,DOP）的概念才被初次正式提出。DM是导致OP发生的危险因素之一,通过高血糖、氧化应激和包括胰岛素、甲状旁腺激素、瘦素等激素水平改变,以直接或间接方式影响骨骼周期性的重建过程,最终导致骨强度的改变。此外,糖尿病视网膜病变使患者视力下降、行动不便,骨折几率大大增加。一旦发生骨折,糖尿病患者较普通患者恢复力更差,死亡率也将进一步增高,是严重的社会健康问题。尽管“糖尿病骨质疏松症”这一糖尿病并发症并不广为人知,但它的发病率不容忽视。有报道显示,在糖尿病患者中约50%的人会并发骨质疏松,且骨质疏松发病率会随着糖尿病病程的延长而不断攀升。因此,有必要进一步探索糖尿病性骨质疏松症的相关发病机制与治疗策略,为DOP的防治提供新的思路。在哺乳动物的生命过程中,骨骼系统总是不间断地进行着自我更新。骨重建过程可以分为三个基本环节:（1）破骨细胞分化,开始骨吸收过程;（2）破骨细胞程序性死亡,骨陷窝内开启骨形成过程;（3）经历类骨质形成、骨骼矿化等过程完全修复破骨细胞介导的骨吸收。健康状态下,破骨细胞和成骨细胞的功能相互协调,使骨形成和骨吸收维持着动态平衡,以维持骨骼完整性。但各类疾病及衰老都会打破骨吸收和骨形的协调状态而导致以骨质疏松症为代表的多种骨代谢性疾病的发生。糖尿病患者骨吸收增强,骨形成下降,骨重建明显失衡。糖尿病导致骨代谢异常的机制是十分复杂的,其中高糖状态扮演着至关重要角色。一方面,高血糖不但可以抑制骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化,还可以通过信号传导级联反应诱导成骨细胞凋亡。另一方面,高糖情况下糖基化终末产物（AGEs）堆积,增加骨骼微环境中巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、NF-κB受体活化因子配体（RANKL）、TNF-α、血管内皮生长因子-A（VEGF-A）等促骨吸收因子的表达,提高破骨细胞的生物活性,增强骨吸收。此外,甲状旁腺激素（PTH）水平升高、胰岛素分泌不足等激素紊乱进一步增强了糖尿病患者骨吸收作用,使骨量进一步丢失。随着肠-骨-脑轴研究的兴起,肠促胰素对骨组织的影响日益受到重视。胰高糖素样受体激动剂（Glucagon Like Peptide-1 Receptor Agonists,GLP-1RA）利拉鲁肽是目前常用的降糖药物。研究发现,胰高糖素样受体（Glucagon Like Peptide-1 Receptor,GLP-1R）在多种组织、器官中广泛表达,GLP-1RA具有多靶点作用。GLP-1RA对维护骨健康具有重要作用。动物层面的研究显示,GLP-1RA利拉鲁肽与艾塞纳肽可以降低去势小鼠血清中骨吸收相关指标抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）及I型胶原（CTX-1）的水平,减少骨骼中破骨细胞的数量,增加骨密度,具有一定的骨保护作用。细胞层面上,GLP-1RA可以促进BMSCs成骨分化。此外,研究报道显示GLP-1RA上调MC3T3-E1细胞GLP-1R表达,激活PI3K-AKT、c AMP-PKA、MEK-ERK、Hedgehog/Gli1信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞分化。但目前关于GLP-1RA对破骨细胞作用分子层面的研究仍较少。有研究表明,GLP-1干预抑制了破骨细胞分化,但该机制可能是一种间接作用,即GLP-1通过位于甲状腺C细胞的GLP-1R调控降钙素的水平,从而间接调节骨吸收。GLP-1RA通过与细胞上的GLP-1R结合而发挥作用。但目前关于破骨细胞表面是否表达GLP-1R仍有争议,而GLP-1RA利拉鲁肽对破骨细胞骨吸收作用机制研究也较少。NFATc1（nuclear factor of activated T cells type c1,NFATc1）是启动破骨细胞基因转录关键因子,在NF-κB、Ca2+,MAPK等信号通路作用下,调控TRAc P、cathepsin K,c-Fos等破骨相关基因表达。研究表明GLP-1RA通过抑制TNF-α表达减弱LPS诱导的破骨细胞活化。TNF-α不仅可以调控单核巨噬细胞极化影响骨吸收,还可以激活在破骨细胞分化调控过程中具有重要作用的NF-κB信号通路。GLP-1RA利拉鲁肽是否直接影响NF-κB与MAPK信号通影响破骨细胞分化,这些问题仍有待于进一步探索。与其他类型的骨质疏松相比,DOP的发病机制涉及到的因素更多、更为复杂。在众多发病机制中,氧化应激最为关键。氧化应激是由于细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）增多导致的一系列生理变化。氧化应激状态下,细胞内ROS增多,机体内氧化和抗氧化的天平倾斜,骨形成受到抑制且成骨细胞凋亡增加,骨重建失衡。目前关于高糖对破骨细胞影响的研究仍不充分,存在分歧。有研究发现高糖促进了破骨细胞的分化,但也有学者认为高糖环境下破骨细胞分化被抑制、破骨细胞骨吸收功能受损。有报道提出GLP-1RA可以改善高糖作用下心血管系统的氧化应激状态,利拉鲁肽是否通过改善破骨细胞内的ROS含量来改变高糖作用下破骨细胞的分化及凋亡?有待进一步研究。综上,本研究旨在细胞和动物两个层面,阐明GLP-1RA利拉鲁肽调控破骨细胞分化的潜在分子机制,对DOP的临床管理及用药提供重要的理论依据。第一部分GLP-1RA利拉鲁肽通过GLP-1R-NF-κB/MAPK信号通路调控破骨细胞分化目的:验证小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7细胞是否表达GLP-1R,探讨不同浓度利拉鲁肽对小鼠破骨细胞破骨分化影响的具体分子机制。方法:1.通过RT-PCR及Western blot技术,分别检测小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞及原代BMMs细胞中GLP-1R的m RNA和蛋白水平;采用免疫荧光方法对小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7细胞中GLP-1R蛋白的表达进行定性分析;2.给予不同浓度的利拉鲁肽（0,10,100,1000n M）对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞及原代BMMs细胞破骨分化过程进行干预,在干预诱导分化的第4天收集细胞,检测破骨细胞特异性分化指标NFATc1,TRAc P和cathepsin K m RNA水平;用抗酒石酸磷酸酶染色法对各组破骨细胞进行染色并计数;通过TRAP活性试剂盒检测各组干预后细胞的TRAP活性。3.使用Western blot方法检测MAPKs和NF-κB信号通路的活化情况,明确利拉鲁肽对MAPKs和NF-κB信号通路的影响;4.使用小干扰RNA沉默GLP-1R。明确敲低GLP-1R是否影响利拉鲁肽对MAPKs和NF-κB信号通路的抑制作用。结果:1.小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7细胞表达GLP-1R。RT-PCR结果显示,小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7细胞样本在111 bp位置处均呈现GLP-1R特异性条带。Western blot分析和免疫荧光检测进一步证实小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7表达GLP-1R蛋白;2.破骨细胞分化标志基因TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA变化趋势表明小鼠原代BMMs细胞及单核巨噬细胞RAW264.7在破骨诱导剂作用下经历特定的破骨分化成熟过程。利拉鲁肽显著抑制了TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA表达。TRAP染色显示利拉鲁肽减少成熟破骨细胞数量,降低细胞TRAP活性;3.利拉鲁肽干预明显抑制NF-κB信号通路磷酸化水平,同时也抑制了MAPKs信号通路中P38,Jnk的活化,表明NF-κB和MAPKs信号通路参与利拉鲁肽对破骨分化的影响过程;4.沉默GLP-1R削弱了利拉鲁肽对NF-κB和MAPKs信号通路的调控作用,提示GLP-1R参与利拉鲁肽对下游级联信号的调控。第二部分GLP-1RA利拉鲁肽通过调控高糖环境下破骨细胞内ROS影响破骨细胞分化、凋亡目的:明确高糖环境对破骨细胞分化、凋亡的影响,探讨GLP-1RA利拉鲁肽对高糖环境中破骨细胞分化和凋亡的影响及潜在的作用机制。方法:1.分别在5.5m M,15m M,25m M及35m M高糖环境下培养RAW264.7细胞,于培养的1天、2天、3天,4天采用CCK8法检测细胞活性。在5.5m M,15m M,25m M及35m M高糖环境下诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化,采用real-time RT-PCR技术分析破骨分化特异性标志物TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA水平情况;2.分别在5.5m M,15m M,25m M及35m M高糖环境下培养RAW264.7细胞,用ROS含量检测试剂盒明确各组干预条件下细胞中ROS的含量变化。干预结束后使用流式细胞分析和Hoechst 33258染色明确RAW264.7细胞凋亡情况;3.利用不同浓度的利拉鲁肽（0,100,1000n M）干预高糖培养的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,用ROS含量试剂盒明确各组干预条件下ROS含量,用流式细胞法明确各组干预条件下凋亡情况;4.使用利拉鲁肽干预高糖环境培养下RAW264.7的破骨分化过程,利用荧光定量PCR对破骨细胞特定的分化标志物TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA水平进行检测;同时使用Western blot技术分析测定MAPKs和NF-κB信号通路的活化情况,明确GLP-1RA利拉鲁肽对高糖环境中破骨分化及相关信号通路的影响情况;5.高糖环境下,利用小干扰RNA转染沉默GLP-1R。检测沉默GLP-1R对利拉鲁肽影响细胞内活性氧含量的变化情况。结果:1.较低浓度的葡萄糖（15m M）增加小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞活性,而高浓度葡萄糖（25m M和35m M）抑制RAW264.7细胞活性;15m M葡萄糖增加破骨分化过程中破骨分化标志基因TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA表达,35m M葡萄糖抑制破骨分化过程中破骨分化特异性指标NFATc1,cathepsin K和TRAc P m RNA表达;2.葡萄糖以剂量依赖性的方式增加RAW264.7细胞中ROS含量,并促进RAW264.7细胞凋亡;3.利拉鲁肽抑制高糖诱导的ROS增加和凋亡,且高剂量利拉鲁肽效果更佳;4.利拉鲁肽干预降低高糖诱导的破骨分化标志基因TRAc P,NFATc1和cathepsin K m RNA表达的增加;利拉鲁肽干预降低了高糖诱导MAPKs和NF-κB信号通路磷酸化水平的增加;5.小干扰RNA沉默GLP-1R后,利拉鲁肽对细胞内ROS的抑制作用明显减弱,表明GLP-1R是利拉鲁肽调控下游信号通路的靶点。第三部分GLP-1RA利拉鲁肽调控糖尿病骨质疏松小鼠破骨分化目的:明确GLP-1RA利拉鲁肽对糖尿病骨质疏松小鼠破骨分化的影响。方法:1.构建小鼠糖尿病骨质疏松模型,应用利拉鲁肽进行干预,验证各组之间血糖,胰岛素,血钙、血磷、股骨重量变化;2.用Elisa法检测糖尿病骨质疏松小鼠及利拉鲁肽干预后骨吸收相关指标TRACP-5b、CTX-1水平变化;3.用HE染色和TRAP染色检测糖尿病骨质疏松小鼠及利拉鲁肽干预后骨微结构及破骨细胞数量变化;4.运用免疫组化和DHE荧光的方法检测糖尿病骨质疏松小鼠及利拉鲁肽干预后骨GLP-1R及骨组织ROS含量;结果:1.糖尿病骨质疏松小鼠模型构建成功,利拉鲁肽干预降低糖尿病骨质疏松小鼠血糖,增加胰岛素,增加股骨质量,对血钙、磷无明显影响;2.糖尿病骨质疏松小鼠血中骨吸收指标TRACP-5b、CTX-1水平增加,利拉鲁肽干预可以明显降低骨吸收指标TRACP-5b、CTX-1水平;3.与正常对照组相比,糖尿病骨质疏松小鼠骨结构紊乱,骨小梁减少,骨实质含量减少,破骨细胞数量增加,利拉鲁肽干预可以降低糖尿病状态下的破骨细胞数量,改善骨微结构;4.利拉鲁肽干预增加骨组织GLP-1R表达,抑制骨组织ROS含量;结论:1.利拉鲁肽通过GLP-1R调控NF-κB和MAPKs信号通路抑制破骨细胞分化;2.高糖情况下,GLP-1RA利拉鲁肽通过抑制RAW264.7细胞内ROS抑制细胞凋亡及破骨分化;3.利拉鲁肽通过增加骨组织GLP-1R水平,抑制骨组织ROS含量,抑制破骨细胞数量,改善骨微结构。