第一部分动脉粥样硬化晚期斑块内细胞凋亡模型的制作背景巨噬细胞是动脉粥样硬化斑块中最常见的细胞类型之一,巨噬细胞凋亡参与了动脉粥样硬化斑块的进展。引起动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡的因素很多,其中最为熟知的为氧化型低密度脂蛋白。氧化型低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡,与巨噬细胞类型和氧化型低密度脂蛋白浓度相关,某些条件下,还能抑制巨噬细胞凋亡。根据斑块内凋亡巨噬细胞聚集大量游离胆固醇的病理特点,有学者提出游离胆固醇的细胞毒作用是斑块内巨噬细胞凋亡的重要原因,且后续研究已经证实Ac-LDL联合ACAT抑制剂培养原代巨噬细胞,能引起巨噬细胞内游离胆固醇的聚集,且出现了与晚期斑块内巨噬细胞凋亡相似的病理学特点。目的为探讨动脉粥样硬化晚期斑块内细胞凋亡相关机制,本研究将参照Ac-LDL联合ACAT抑制剂培养原代巨噬细胞的方法,制作动脉粥样硬化晚期斑块内巨噬细胞凋亡模型。方法向8-10周龄雌性C57BL/6小鼠腹腔注射0.5ml含40μg刀豆球蛋白A的PBS。3天后通过灌洗腹腔的方法获取原代巨噬细胞,在含有10%胎牛血清的DMEM中培养24-48小时,直到细胞生长融合。后分四组：①FC-AMs组--更换培养基,换入含100μg/ml Ac-LDL和10μg/ml ACAT抑制剂compound58035的DMEM继续培养16-20小时；②UV-AMs组—凋亡鉴定前2小时,紫外线照射细胞15分钟,后放入培养箱继续培养；③坏死细胞组—凋亡鉴定前2小时,将细胞放入56℃环境中培养30分钟,后放入培养箱继续培养；④活细胞组—原代细胞在培养箱中常规培养,不作处理。所有细胞均采用Annexin V-FITC/PI试剂盒标记,通过FACS和间接免疫荧光细胞化学法进行凋亡检测。结果LSCM显示凋亡细胞(Annexin V+细胞)比例分别是：①活细胞组2.64%；②FC-AMs组9.67%,与活细胞组相比,差异有统计学意义,P<0.005；③UV-AMs组10.77%,与活细胞组相比,差异有统计学意义,P<0.005；与FC-AMs组相比,差异无统计学意义,P>0.05；④坏死细胞组基本全部死亡。FACS显示：①FC-AMs组凋亡细胞比例20.9%,其中晚期凋亡细胞12.7%；②活细胞组凋亡细胞比例10.6%,其中晚期凋亡细胞6.6%。结论Ac-LDL与ACAT抑制剂compound58035联合作用,能诱导C57BL/6小鼠原代巨噬细胞凋亡,细胞凋亡率与UV-AMs组相比,差异无统计学意义。动脉粥样硬化晚期斑块内巨噬细胞凋亡模型复制成功,为后续进一步阐明凋亡细胞吞噬清除机制奠定了基础。第二部分晚期凋亡巨噬细胞PTX3的检测及意义背景PTX3是一种与CRP和SAP同属于正五聚蛋白超家族的急性时相蛋白。在炎症信号的作用下,由多种细胞表达,如DCs、巨噬细胞、成纤维细胞、激活的内皮细胞和肾细胞等。动脉粥样硬化过程本质上是由巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等多种细胞参与的长期慢性炎症反应,目前已经证实在动脉粥样硬化晚期斑块内存在PTX3的高表达,急性心肌梗死患者血浆中PTX3水平明显升高。在不稳定型心绞痛患者中,PTX3达到高峰是在6-8小时,血浆PTX3浓度明显升高致正常的3倍(6.20ng/mL),而CRP达到高峰的时间为24小时。有学者预言,PTX3将有望取代CRP而成为更具临床应用价值的心血管事件预测指标。这些提示,PTX3与动脉粥样硬化有关,可能参与了动脉粥样硬化的发展过程。目的在本课题第一部分的基础上,我们将进一步探讨动脉粥样硬化晚期斑块内凋亡巨噬细胞与PTX3的关系,为阐明PTX3在动脉粥样硬化的作用机制奠定基础。方法参照本课题第一部分的方法,制备动脉粥样硬化晚期斑块内细胞凋亡模型。利用间接免疫荧光细胞化学法和FACS法分别检测FC-AMs上PTX3的水平,同时设立活细胞组、UV-AMs组及坏死细胞组进行对照。使用ImagePro Plus软件分析LSCM的检测结果。结果LSCM检测结果示：活细胞组PTX3水平很低,平均光密度值为0.0191±0.0266,而凋亡细胞组(UV-AMs和FC-AMs)显示了更高水平的PTX3,平均光密度值分别为0.2645±0.0682和0.2142±0.0291,同型对照或死亡细胞组基本或完全没有检测到PTX3。FC-AMs组的PTX3水平与同型对照组PTX3水平相比,差异具有统计学意义,P<0.005; FC-AMs组的PTX3水平与活细胞组PTX3水平相比,差异具有统计学意义,P<0.005。FACS检测结果显示：Annexin V-FITC/PI与荧光抗体分开标记时,随着凋亡细胞比例的增多,相应组PTX3的荧光信号逐渐增强,尤以Annexin V+/PI+(晚期凋亡细胞)区域,PTX3的荧光信号更加明显。Annexin V-FITC/PI与荧光抗体联合标记时,Annexin V+(凋亡细胞)区域与Annexin V-/PI-(活细胞)区域和Annexin V-/PI+(死亡细胞)区域相比,PTX3荧光信号更明显。结论PTX3在正常培养的活巨噬细胞、游离胆固醇诱导的早期凋亡巨噬细胞和热变性的死亡巨噬细胞中表达水平都很低。在动脉粥样硬化晚期斑块凋亡细胞模型FC-AMs和紫外线诱导的凋亡细胞模型UV-AMs中,PTX3的表达水平很高,其机制与巨噬细胞发生晚期凋亡有关。第三部分PTX3介导的凋亡细胞吞噬清除机制研究背景PTX3是先天体液免疫的重要组成部分,能够激活补体经典途径而介导多种凋亡细胞(如Jurkat细胞)的吞噬清除。在防御病原体感染和自身免疫性疾病中具有重要作用。细胞凋亡是动脉粥样硬化斑块内发生的连续性事件,早期斑块内的凋亡细胞因其能及时有效被吞噬清除,不会对机体造成损害,反而会激活机体的抗炎症反应途径而对机体有利。晚期斑块内凋亡细胞吞噬清除机制障碍,会导致凋亡细胞的堆积、脂质池的扩大、细胞坏死及内容物释放,引发过度的炎症反应,进一步加重了动脉粥样斑块的不稳定性。这提示凋亡细胞的有效清除与否,在动脉粥样硬化斑块进展中具有重要作用。目前已报道急性冠脉综合征患者血浆PTX3水平明显升高。作为在凋亡细胞免疫清除反应中起重要作用的先天体液免疫分子,至今尚不清楚PTX3是否也参与了动脉粥样硬化斑块内凋亡细胞的吞噬清除过程。目的探讨PTX3是否介导了动脉粥样硬化晚期斑块内凋亡细胞的吞噬清除过程,为阐明急性冠脉综合征易损斑块的形成机制奠定基础。方法按照第一部分的方法制备动脉粥样硬化晚期斑块内凋亡细胞模型,即FC-AMs。收集FC-AMs并用DiI红色荧光染料进行标记,用不同浓度PTX3封闭剂16B5(5μg/ml和50μg/ml))和16B5的同型对照(5μg/ml)孵育FC-AMs,将孵育后的FC-AMs加入到2小时前分离的C57BL/6小鼠原代巨噬细胞(即吞噬细胞)中,放置二氧化碳培养箱30分钟,进行吞噬反应。吞噬反应结束后强力冲洗未被吞噬的FC-AMs, LSCM下观察FC-AMs的吞噬情况,统计吞噬率。结果在吞噬细胞内可见到明显红色皱缩细胞及部分细胞碎片,说明FC-AMs已被吞噬细胞吞入其中。在不同浓度PTX3封闭剂16B5(5μg/ml和50μg/ml)和16B5的同型对照(50μg/ml)的作用下,凋亡细胞吞噬率分别为26.19±4.12%、14.63±1.56%和36.4±4.25%。5μg/ml16B5组与50μg/ml16B5组相比,吞噬率差异具有统计学意义,P<0.05；50μg/ml16B5组与50μg/ml的同型对照组相比,吞噬率差异具有统计学意义,P<0.005。结论分离培养2小时的巨噬细胞能吞噬FC-AMs, PTX3封闭剂16B5能浓度依赖性地阻止吞噬细胞对FC-AMs的吞噬作用。PTX3介导了动脉粥样硬化晚期斑块细胞模型中晚期凋亡细胞的吞噬清除作用。