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结球甘蓝（BrassicaoleraceaL.var.capitataL.），简称甘蓝，是十字花科芸薹属甘蓝种中两年生的重要蔬菜作物。甘蓝为典型的异花授粉作物，具有自交不亲和的特点，长期依赖于人工蕾期自交授粉繁殖自交不亲和原种，工作量大，杂交率很难达到100％。进入本世纪以后，甘蓝杂交育种的重点转向了雄性不育系的选育和利用。其中细胞质雄性不育（CMS）的利用最为普遍，存在恢复源限制，胞质负效应、胞质单一化等问题。 针对当前甘蓝雄性不育工作中存在的雄性不育遗传资源狭窄，过度利用萝卜OguraCMS不育源，单一胞质使用的潜在风险以及因严重缺乏优良甘蓝自交亲和系制约了甘蓝雄性不育杂交育种发展和应用等问题，本研究拟通过甘蓝细胞核不育系和自交亲和性系的创制，扩大甘蓝雄性不育资源，规避单一胞质使用风险，促进甘蓝雄性不育杂交育种的发展。 随着控制甘蓝雄性不育和自交不亲和性基因明确，以基因组编辑为主的反向遗传学技术可以对目的基因的靶位点进行定点改造，为培育自交亲和的雄性不育系提供了可能。本试验以甘蓝为研究对象，利用RNAi、优化的CRISPR/Cas9等技术，对甘蓝BoEMS1、BoSRK以及BoDAD基因进行调控和编辑，以期获得综合性状优良稳定的雄性不育材料的同时解决保持系与不育系杂交亲和性的问题。本研究获得的结果如下： 1、构建了以Bar基因为筛选标记的表达载体PCA13BarPAtEMS1-EMS1，通过花序浸染法转化拟南芥ems1/+突变体。收获T0代种子后，筛选出带有Bar基因标记同时基因型背景为ems1/ems1的阳性转化株1株。体视显微镜观察结果显示，该基因型背景下的花药具有明显的花粉，自交结籽饱满均一。表明甘蓝BoEMS1基因能够恢复拟南芥ems1/+突变体基因型及不育表型，基于此推测BoEMS1基因与甘蓝雄性不育相关。 2、构建了以潮霉素（Hyg）为筛选标记的干扰表达载体PCA1300PEMS-iEMS1、PCA1300PEMS-iEMS1/iSRK，分别通过农杆菌介导法将其导入甘蓝自交不亲和系?F416?（属于SRK3单倍型）中。试验结果获得的来自2个愈伤组织的7株单干扰和来自7个愈伤组织的25株双干扰转基因植株。观察开花表型发现7株单干扰转基因植株中有1株表现为不育，2株严重退化，其余4株表型正常；25株双干扰转基因植株中仅有6株表现出明显的雄蕊退化。花粉活力测定试验结果显示转基因植株花粉活力远低于野生型植株花粉活力；花粉原位萌发的荧光显微观察结果显示，单干扰植株花粉粒吸附在柱头表面大量萌发并未有形成花粉管穿过柱头，而双干扰植株花粉粒吸附柱头上表面大量萌发且部分形成花粉管束穿过柱头进入花柱。通过RNAi干扰试验，初步认为转基因植株的育性与亲和性在一定程度上均受到影响。同时构建了以Bar基因为筛选标记的敲除表达载pCA13BarCasEMSABC/tSRK,通过农杆菌介导法将其导入甘蓝自交不亲和系?F416?，筛选后获得阳性转化株60株，其中BoEMS1基因靶位点发生编辑的有7株，编辑效率为11.7%，选取9个单株（BoEMS1基因突变7株和随机挑选两单株）检测BoSRK基因在靶位点的突变情况，其编辑效率为100%。 3、构建以Bar基因为筛选标记的双干扰表达载体pCA13BariDAD/iSRK、敲除载体pCA13BarCasDADAB/tSRK。通过农杆菌介导法将其导入甘蓝自交不亲和系?F416?，筛选后获得阳性转化株60株，其中检测到DAD基因靶位点发生突变的仅有1株，编辑效率为1.7%，但检测的3株阳性转化株中BoSRK基因靶位点突变编辑效率为100%。筛选后获得双干扰阳性转化株26株，随机选取4株，野生型单株作为对照，利用实时定量PCR技术对接种软腐病菌后茉莉酸生物合成途径的关键结构基因DAD1,以及其下游LOX、AOS、AOC、OPR3基因进行表达分析。结果显示：接种软腐病菌前，RNAi转基因植株中各基因mRNA积累量明显低于野生型?F416?对照株；接种软腐病菌后，各单株中各基因mRNA积累量均高于接菌前积累量，但增加量明显低于野生型所增加积累量。另外，比较花药的发育以及开花当天雄蕊的散粉情况发现，个别植株出现花药严重退化，开花当天花药开裂较晚且散粉量少；花粉原位萌发的荧光显微观察结果显示花粉粒吸附柱头上表面大量萌发且部分形成花粉管束穿过柱头进入花柱，以上两个试验表明转基因植株在育性与亲和性方面均受到了影响。