玉米紫色酸性磷酸酶基因的鉴定和表达特性分析

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yangjianguo20
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磷是植物生长发育必需的大量元素之一。土壤中的磷多数以有机态形式存在,这种形态的磷不能被植物直接吸收,紫色酸性磷酸酶(Purple Acid Phosphatase, PAP)是一种广泛存在于植物中的金属磷酸酯酶,能分解土壤中含量丰富的有机态磷,释放无机磷供植物吸收利用。拟南芥、水稻、大豆中均鉴定了各自基因组中的PAP基因家族。本研究利用生物信息学手段鉴定玉米基因组中的PAP家族基因,并对其基因结构、染色体分布、蛋白生化特性及进化关系进行了分析,然后通过基因克隆、半定量、实时荧光定量及亚细胞定位等技术分析其基因的功能,主要研究结果如下:(1)利用玉米基因组数据库的信息和本地化Blastp方法,共鉴定了25个ZmPAP基因,分别分布在1、2、3、4、6、7、9、10共8条染色体上,5、8号没有。ZmPAP氨基酸序列分析表明:氨基酸长度从253到594,蛋白质分子量在31.833 KDa到67.230 Kda之间;等电点在5.21到7.07之间。蛋白质的结构域分析发现,25个ZmPAP中,19个蛋白包含紫色酸性磷酸酶特有的5个保守基序和7个金属配对残基。系统进化分析发现,玉米PAP与水稻的亲缘关系较近。(2)低磷胁迫处理下,利用半定量对8个ZmPAP基因在玉米磷高效材料178和低磷敏感9782的根和叶中的表达模式进行分析。低磷胁迫处理下,7个ZmPAF基因呈现表达差异,其中,ZmPAP5b、ZmPAP20d和ZmPAP26a均只表现为组织差异,ZmPAP5b在根中下调表达,叶中上调表达,而ZmPAP20d和ZmPAP26a表达模式则与之相反;ZmPAP5c和ZmPAP26b只在9782叶中上调表达;ZmPAP27c在178和9782的叶中均下调表达。(3)根据半定量结果,选择5个基因进行克隆,其编码区长度大约在1300bp左右。对氨基酸序列分析发现,ZmPAP5c缺失了第二个基序,其中含有两个金属配对残基D和Y。其余四个基因的氨基酸序列包含有5个保守基序(DXG/GDXXY/GNHE(D)/VXXH/GHXH)。(4)采用qRT-PCR分析ZmPAP基因在178和9782的根与叶中的表达模式,结果表明:ZmPAP26a和ZmPAP26b只在9782叶中下调表达,ZmPAP27c只在178和9782叶中出现差异表达,并且在12 h表达量达到最高;ZmPAP5b在两个材料中的表达均受低磷抑制,而ZmPAP5c的表达只在178叶中低磷处理12h时被强烈上调表达。(5)分离到的ZmPAP26a和ZmPAP27c与荧光表达载体pAcGFP1-N1连接,转化到洋葱表皮细胞里,进行亚细胞定位,结果表明,ZmPAP26a和ZmPAP27c初步被定位在细胞膜上。(6)采用p-NPP法分析低磷处理后酸性磷酸酶活的变化情况,结果表明:在低磷胁迫情况下,根系的APase活性比叶中的高,并且白交系178苗期根系的APase活性变化较9782更加灵敏;此外,在178中新叶酶活比老叶高,而9782则相反。
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