论文部分内容阅读
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起偶蹄动物高度感染和造成严重经济损失的传染病,影响着全世界的畜牧业和国际贸易。FMDV的全病毒粒子(146S)是制造灭活疫苗的最有效抗原,但是在稍低于中性pH值的环境中,146S是高度不稳定的,导致FMDV的衣壳蛋白解聚为五聚体亚单位,影响灭活疫苗的有效抗原含量,造成疫苗的效力降低。为了发展酸稳定的疫苗候选毒株,也为了验证VP2D86H替换能否使FMDV获得酸稳定性以及研究酸稳定性FMDV的耐酸表型的分子机制,利用实验室已有的O型FMDV感染性cDNA克隆,构建了含有6种氨基酸残基突变(VP1N17D、VP2H145Y、VP2 D86H、VP3 H141D、VP3 H141G和VP1N17D+VP2H145Y)的FMDV全长cDNA克隆,转染BSR/T7细胞进行病毒拯救。CPE观察和间接免疫荧光实验表明拯救出了含有VP1N17D、VP2D86H、VP2H145Y和VP1N17D+VP2H145Y替换的FMDV,而VP3H141G/D的替换对亲本病毒是致死的。RT-PCR和序列测定表明分别含有VP1N17D和VP2D86H氨基酸突变的拯救病毒rN17D和rD86H能够稳定传代,而分别含有VP2H145Y和VP1N17D+VP2H145Y替换的拯救病毒rH145Y和rN17D2在第1代发生了回复突变和伴随突变。随后对拯救病毒rN17D、rD86H和rN17D2进行了一列的特性分析。对拯救病毒的理化性质的研究表明VP1N17D和VP2D86H氨基酸残基替换都可以各自增强亲本FMDV O/HN/93的酸抗性、热抗性和碱抗性。但是,与含有VP1N17D替换的FMDV相比,含有VP2D86H替换的FMDV表现出高的复制能力和强的乳鼠致病力。两个拯救病毒的血清中和能力也不相同,这与VP1蛋白17位氨基酸残基和VP2蛋白86位氨基酸残基到抗原位点1和抗原位点5的距离差异相关。本研究第一次证明了VP2D86H替换负责O型FMDV的酸稳定性和热稳定性,也证明了拯救病毒rD86H的综合性能优于rN17D病毒。因此,FMDV rD86可以作为发展稳定性灭活疫苗的候选毒株。本研究也表明了同一个氨基酸替换在不同血清型和血清亚型的FMDV中可以产生不同的效果。