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目的:探讨柚皮素对炎性刺激时气道上皮细胞黏液高分泌的作用和相关的分子机制。方法:(1)体外培养人气道上皮细胞系HBE16细胞,将细胞分为7组,分别以0、20、50、80、100、200、400μmol/L的柚皮素处理,采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测柚皮素对细胞活性的影响,并确定柚皮素的作用剂量。(2)给予不同浓度(5nmol/L、25nmol/L和50nmol/L)的人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)刺激24 h,观察刺激前后细胞的生长和增殖情况,分别采用ELISA技术及PCR检测各组细胞中MUC5AC蛋白含量及转录水平的变化情况,并测定活性氧(ROS)成分的相对含量;(3)将细胞分为5组:①对照组;②HNE(50nmol/L)刺激组;③柚皮素(100μmol/L)干预组;④活性氧清除剂DMTU(20μmol/L)干预组;⑤柚皮素(100μmol/L)+DMTU(20μmol/L)干预组。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组MUC5AC mRNA、EGFR mRNA的变化;Western免疫印迹法(Western blot)检测EGFR、p-EGFR、PI3K、PKB、p-PKB和NF-κB蛋白的表达;酶链免疫吸附法(ELISA)定量分析MUC5AC蛋白含量的差异;激光共聚焦技术进一步直接观察MUC5AC蛋白含量的变化;结果:(1)MTT结果显示柚皮素浓度低于100μmol/L时对细胞无明显损伤,随着浓度递增,当柚皮素浓度达200μmol/L和400μmol/L时细胞贴壁能力降低,死亡细胞增多,细胞生存率明显下降,此表明100μmol/L的柚皮素为最佳作用剂量;(2)在5nmol/L、25nmol/L和50nmol/L的HNE刺激后的各组细胞中MUC5AC的转录水平及蛋白含量均增高,ROS含量亦随之增加,呈浓度依赖性增高,均高于正常对照组;给予柚皮素预处理后ROS的含量明显减少,与50nmol/L的HNE刺激组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。(3)50nmol/L的HNE刺激后引起MUC5AC、EGFR基因转录和蛋白表达水平明显高于正常对照组(P<0.01),同时伴随p-EGFR、PI3K、PKB、p-PKB及NF-κB蛋白水平的增高,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);柚皮素干预后,RT-PCR测定MUC5AC mRNA和EGFR mRNA均较HNE刺激组明显下调,Western blot的结果也表明相应的EGFR和p-EGFR蛋白表达明显降低,其下游因子PI3K、PKB、p-PKB及NF-κB蛋白表达也有不同程度的减弱(P<0.05);DMTU和柚皮素+DMTU均同样降低了MUC5AC、EGFR的基因转录、蛋白产物水平以及p-EGFR、PI3K、PKB、p-PKB及NF-κB蛋白相对含量;柚皮素+DMTU干预组与单纯性柚皮素组和DMTU组比较差异均有统计学意义(P<0.05);酶链免疫吸附法测定结果表明经柚皮素预处理后MUC5AC蛋白表达减少;激光共聚焦观察结果也显示柚皮素处理后HBE16细胞质中MUC5AC蛋白表达减弱。结论:(1)HNE能刺激气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC基因转录及蛋白合成分泌增加,且伴有ROS含量的显著增高;而柚皮素能降低细胞内ROS水平。(2)HNE通过增加ROS含量,上调EGFR的表达水平和增加其磷酸化水平引起MUC5AC表达增强。(3)柚皮素可抑制ROS的产生、下调ROS诱导的EGFR表达水平、并部分阻断EGFR磷酸化,在一定程度上阻断了下游信号通路PI3K/PKB的作用,从而对炎性刺激因素所导致的气道黏液高分泌起抑制作用。