研究背景根据世界卫生组织Vorld Health Organization, WHO)的定义,骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是以骨量减低和骨微结构破坏,而引起骨脆性增加和容易出现骨折为特征的一种全身性代谢性骨病。随着医疗技术的不断提高,人类的寿命得以不断延长,同时,由于计划生育的开展,我国已经步入老龄化社会,我国的骨质疏松患者日渐增多,骨质疏松症已然成为重要的公共健康问题。骨质疏松患者常有乏力、骨痛等不适,此外,还可引起骨质疏松性骨折,即脆性骨折,在遭遇轻度外伤或者平常生活中就会出现的骨折,引起死亡人数和残疾人数的增长,严重影响着人们的生活质量。此外,骨质疏松性骨折的治疗耗资较大,给患者及其家属甚至社会均带来难以承受的重担。然而,我们必须引起重视的是,骨质疏松性骨折是可以预防以及治疗的,所以,大力宣传骨质疏松基本知识,提前做好预防举措,实现早期诊断和治疗尤其关键。雷奈酸锶(strontium ranelate, Sr)是一种新型的抗骨质疏松药物,它既能够作用于破骨细胞,拮抗骨吸收,又能够作用于成骨细胞,增加骨形成。不少临床研究均证实,雷奈酸锶可以明显增加骨密度,改良骨微结构,从而减少出现椎体骨折或者非椎体骨折。目前,已有一些研究支持雷奈酸锶可在细胞水平上促进骨形成,例如Choudhary等的实验表明,Sr通过调控环氧化酶-2(COX-2,为前列腺素E2(PGE2)的产物)促使BMSCs成骨分化、成骨细胞的增生以及抗凋亡；Peng等的实验则表明,Sr可以显著增加成骨相关基因的表达及碱性磷酸酶(ALP)活性,同时伴随着磷酸化ERK1/2和p38分子的表达增多,但这种促进作用能被选择性细胞外调节激酶1/2(ERK1/2)和p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的抑制剂(PD98050和SB203580)所阻断；Fromigue等认为激活T细胞核因子c1 (nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1)后,使下游的Wnt信号通路相关分子表达增多,可以促使Sr诱导BMSCs向成骨分化。我们的前期研究发现,雷奈酸锶能够通过激活转化生长因子β1 (TGF-β1) /smad2、骨形成发生蛋白2(BMP2)/smad1/5/8、Sonic Hedgehog(Shh)及下游的转录因子Runx2的活性,继而诱导BMSCs向成骨分化。其中,Hedghog通路是最近几年备受重视的一条信号通路,不少研究均表明它是调控骨形成、促进成骨分化的一条关键信号通路,对脊椎动物骨骼系统的形成及发育起重要的调节作用,然而Hedgehog通路能否通过其下游信号分子Gli在雷奈酸锶促进BMSCs成骨分化中起作用,目前尚未完全明了。因此,本实验拟在本研究组的前期研究基础上,进一步观察Hedgehog/Gli通路在Sr促使BMSCs分化为成骨细胞过程中的作用。研究方法1大鼠BMSCs的分离、纯化及培养取1只4周龄的SD大鼠,采用颈椎脱臼法处死大鼠后,将其浸泡在75%的乙醇中消毒5 min,取出放置在预先经紫外线消毒过的超净台上,在无菌条件下剪开大鼠的皮肤、肌肉,分离出两侧的股骨和胫骨,将骨周围的肌肉和筋膜等组织尽量剔除干净,小心剪去股骨近端及胫骨远端使骨髓腔暴露,用DMEM/F12完全培养基反复冲洗骨髓腔,收集含细胞的培养基至15 ml的无菌离心管中,1000 rpm离心5 min,离心后弃去上清液,在离心管中再加入5m1的DMEM/F12完全培养基重悬细胞,然后将细胞悬液接种至25 cm2的培养瓶中,放置于37℃、含5%C02的培养箱中进行培养。24 h后待细胞贴壁行首次换液,以后每隔2-3d换液1次,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态及细胞形态,直至细胞生长达80%-90%融合时进行1：2或1：3传代纯化。2 BMSCs的成骨分化待BMSCs传代至第3-5代时,将细胞种植于培养皿或者培养板中,待细胞生长达80%-90%以上融合后,根据不同实验组的要求加入不同的干预措施以及含10%胎牛血清、1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lp-甘油磷酸钠和50 mg/L抗坏血酸的DMEM/F12培养液配制而成的成骨诱导液进行培养。3 Western blot法检测Gli1和Runx2蛋白的表达待BMSCs传代培养至第3代时,将细胞接种在60 Im的培养皿中,各实验组给予不同的干预措施后,开始操作。弃去细胞原培养液,用预冷的PBS洗2遍,将皿中剩余的PBS吸干,然后在皿中加入适量细胞裂解液,放置在4℃冰箱进行裂解30 min,裂解完成后收集细胞,于12000 rpm离心10 min,取上清,采用BCA蛋白定量试剂盒开始进行蛋白定量。经SDS-PAGE分离总蛋白后,将蛋白转移至PVDF膜上。进行封闭(5%的脱脂奶粉1h),随后开始敷抗体,分别加入Glil抗体(1：200)和Runx2抗体(1：1000),4℃过夜,然后用TBST将膜洗3遍,每遍5 mmin,随后敷羊抗兔二抗(1：4000),常温孵育90 min,再用TBST将膜洗3遍,每遍5min。取出膜,暗室中用ECL发光试剂进行显色,曝光,最后采用凝胶成像系统扫描,进行统计分析。4 ALP活性检测待BMSCs传代培养至第3代时,将其接种于24孔板中,根据不同实验组要求给予相应的干预措施,培养细胞7d后,直接将上清吸去后,在培养板中加入适量裂解液充分裂解,裂解30-40mmin后,用微量移液器吸出液体(可根据需要用生理盐水或PBS进行一定的稀释),遵照碱性磷酸酶试剂盒的说明书添加试剂,采用酶标法在酶标仪492 nm波长下检测细胞内ALP的活性。5茜素红钙结节染色待细胞传代培养至第3代时,将细胞接种于6孔板中(板中预先放置24mm×24mm盖玻片)。根据不同实验组要求给予相应的干预措施,在第21 d时收集细胞,按照茜素红钙染色试剂盒的说明书进行操作。依次予样本固着、染色和澄清处理,随后在倒置显微镜下观察钙结节的染色情况并进行计数。计数时每组选3个样本,每个样本随机选1个视野(×100),计数后开始统计各组间的差异。6 RNA干扰技术设计3条Gli1-siRNA和1条阴性siRNA (non-target siRNA)。整个过程均采用无RNA酶的试剂。转染操作前,需将新买回来的siRNA冻干粉按说明书配成浓度为20μmol/L的储存液,分装置于-20℃冰箱中储存。待细胞传代培养至第3代时,将细胞接种于细胞至培养皿或培养板中,放置在培养箱中培养,待细胞融合至60%～70%时可进行转染操作。根据siRNA的说明书配制siRNA-Lipofectamine2000混合液。转染6 h后,吸走转染液,加入新鲜的完全培养基,根据实验目的予不同干预措施。7统计学处理数据经SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析,结果均以均数±标准差(mean±S D)来表示,组间比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验,在方差齐的情况下,两两比较使用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1 Sr上调BMSCs的Glil表达不同浓度Sr(0.1、1、3、5mmol/L)处理BMSCs 7 d后,Glil蛋白表达均显著高于对照组(P<0.01),在Sr浓度为0,～3 mmol/L范围内呈一定的浓度趋势,且Sr浓度为3 mmol/L时,Gli1蛋白表达处于峰值；在Sr浓度为5mmol/L时,Sr对Gli1蛋白的促进作用稍减弱,但仍明显高于对照组(P<0.01)；然而Sr浓度达到10mmol/L时,Gli1蛋白表达则与对照组无差异(P>0.05)。使用3 mmol/L Sr处理BMSCs 3 d时,细胞内Gli1蛋白表达水平与对照组比较,差异不明显(P>0.05),而处理5 d、7 d、14 d后,Glil表达均显著高于对照组(P<0.05或<0.01),且在7 d时Gli1蛋白表达最多。2 Hh受体阻断剂Cy抑制Sr对Glil蛋白的上调作用3 mmol/L Sr处理BMSCs 7d后,Gli1蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01)。当同时应用10μmol/L Cy和3 mmol/L Sr处理BMSCs 7d后,与单独Sr组比较,Gli1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；然而单独使用10μmol/L Cy时,则对Gli1蛋白的基础表达无明显影响(P>0.05)。3 Glil-siRNA有效链的筛选与non-target小干扰RNA (siRNA)组相比较,Gli1-siRNA001未能降低Gli1表达,差别无统计学意义(P>0.05),而Glil-siRNA002及Glil-siRNA003均能降低Gli1蛋白的表达(P<0.05),其中Glil-siRNA002的作用最为明显(P<0.01)。4 Glil-siRNA抑制Sr对BMSCs Glli1表达的上调作用3 mmol/L Sr处理BMSCs 7 d,Glil表达较对照组明显增加(P<0.01)：Gli1-siRNA及non-target siRNA分别转染BMSCs后,再予3mmol/L Sr处理细胞7d, Gli1-siRNA可以显著抑制Sr对Gli1蛋白表达的促进作用(与单纯Sr组比较,P<0.01),而non-target siRNA组则对Sr促进Gli1蛋白表达的作用无明显影响(与单纯Sr组比较,P>0.05)。5 Glil-siRNA抑制Sr对BMSCs Runx2表达的上调作用3 mmol/L Sr处理BMSCs 7 d, Runx2表达较对照组明显增加(P<0.01)；Gli1-siRNA及non-target siRNA分别转染BMSCs后,再予3 mmol/L Sr处理细胞7d, Glil-siRNA可以显著抑制Sr对Runx2蛋白表达的促进作用(与单纯Sr组比较,P<0.01),而non-target siRNA组则对Sr促进Runx2蛋白表达的作用无明显影响(与单纯Sr组比较,P>0.05)。6 Glil-siRNA拮抗Sr对ALP活性的促进作用与对照组相比,3 mmol/L Sr处理BMSCs 7 d明显增加ALP活性(P<0.01)；Gli1-siRNA及non-target siRNA分别转染BMSCs后,再予3mmol/L Sr处理细胞7 d, Gli1-siRNA可以显著抑制Sr对ALP活性的促进作用(与单纯Sr组比较,P<0.01),而non-target siRNA组则对Sr促进ALP活性的作用无明显影响(与单纯Sr组比较,P>0.05)。7 Glil-siRNA拮抗Sr对钙结节形成的促进作用3 mmol/L的Sr处理BMSCs 21 d后,可明显增加钙结节的数量(与对照组比较,P<0.01)；Gli1-siRNA转染BMSCs后,使Sr对钙结节形成的促进作用受到明显抑制(与单纯Sr组比较,P<0.01),而non-target siRNA转染后,对Sr促进钙结节形成的作用无明显影响(与单纯Sr组比较,P>0.05)。结论1 Sr可通过激活Hh受体上调Glil表达；2 Glil分子在Sr促进BMSCs向成骨分化中起着重要作用,包括上调Runx2蛋白表达,增加ALP活性及促进钙结节形成；3激活Hedgehog/Gli1通路可能是Sr促进BMSCs向成骨分化的重要机制之一。