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精子介导转基因方法(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是生产转基因动物的有效途径,具有简便、高效等特点,但机制至今不明确,成了限制这种方法发展运用的瓶颈和世界性难题,造成SMGT存在着极大的随机性和不确定性。目前国际上对此研究较少,且主要集中在CD4分子上。众多蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的,基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。我们前期研究证明CD4分子在山羊精子结合内化外源DNA过程中起到主要作用,并以其为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统,筛选与CD4相互作用的8个候选分子。本研究对其中两个主要的候选分子：RanBP9和CD320,进行基因克隆、序列分析、组织表达与基因多态性分析,为进一步揭示这些候选分子在山羊精子转运外源DNA的作用,深入研究精子介导基因转移的机制奠定基础。RanBP9(Ran binding protein9,Ran结合蛋白9)在胚胎干细胞中可以白行发育,且在精子和卵子发生过程中具有重要调节作用。CD320参与体内免疫反应,扮演受体重要角色,能够介导物质和信号的转移与转运。由于在山羊上这两个基因的研究尚属空白,本研究参考GenBank发表的其他物种的序列,在高度保守区域设计特异性引物,通过RT-PCR方法克隆山羊RanBP9和CD320基因,并对其核苷酸序列、氨基酸序列及预测的蛋白质高级结构进行分析。同时,检测RanBP9和CD320基因在山羊不同组织中的表达水平。最后,利用聚合酶链式反应—单链构象多态性(PCR-single stranded conformational polymorphism, PCR-SSCP)技术,分析CD320基因在大足黑山羊和南江黄羊的遗传多态性。主要结果如下：1.首次克隆了山羊RanBP9基因(GenBank登录号：KF425511.1)和CD320基因(GenBank登录号：KF425510.1), cDNA序列分别为1008bp和517bp。2. RanBP9的开放阅读框(ORF)为936bp,位于2～937bp,编码312个氨基酸残基,在937bp处和2bp分别有加信号；CD320的ORF长459bp,编码153个氨基酸,在463bp处和2bp分别有加信号。采用SMART程序分析表明,.山羊RanBP9氨基酸序列中1-54bp和72-196bp处为未知区域,55-71bp处为低耦合区域,197-299bp处为智能区域；CD320氨基酸序列中100-122bp处为低密度脂蛋白受体结构域,18-56bp处为跨膜区。用BLAST进行序列比对显示,山羊RanBP9基因与恒河猴(Macaca mulatta)、大猩猩(Gorila gorilla)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和蜥蜴(Japaluea brevipes)的同源相似性都很高,达99％；与牛(Bos taurus)、蟾蜍(Fel bufonis)和斑马鱼(Danio rerio)的同源相似性分别为86%、83%和75%；山羊CD320基因与绵羊(Ovis aries)、牛(Bos taurus)同源相似性分别是98%、96%,与海豚(Takifugu rubripes)、虎(Panthera tigris).鲸鱼(Orcinus orca).大熊猫(Ailuropoda melanolruca)、马(Equus zebra)和家猫(Pardofelis marmorata)的同源相似性分别是83%、77%、76%、75%、74%和73%。用expasy网站对蛋白疏水性预测,结果显示RanBP9疏水性峰值负值较高,为亲水性；CD320疏水性峰值正值较高,为疏水性。用TMPRED对蛋白进行跨膜性预测,结果显示RanBP9在281-298bp处出现跨膜结构,CD320在103-122处出现跨膜结构,二者均为跨膜蛋白。对两种蛋白进行结构位点分析,显示RanBP9蛋白存在3个N-糖基化位点、2个多糖链接位点和7个蛋白激酶C磷酸化位点；CD320蛋白含有5个N-糖基化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个酰胺化位点和2个异戊烯基结合位点。在NCBI上进行信号肽预测分析,二者均未检测出信号肽。3.采集大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、胰脏、肌肉、睾丸、卵巢和胸腺等组织样品,并提取总RNA,采用半荧光定量PCR的方法检测RanBP9和CD320两个基因组织相对表达量。结果显示RanBP9和CD320在山羊的心、肝、脾、肺、肾、胰脏、肌肉、睾丸、卵巢和胸腺等组织中均有表达,其中RanBP9在睾丸中表达量最高,CD320在脾脏和睾丸组织中表达量较高。4.采集大足黑山羊和南江黄羊血液,样本数均为30只,提取全血DNA,设计特异性引物,利用PCR-SSCP技术,研究CD320基因的遗传多态性。结果显示,大足黑山羊和南江黄羊CD320基因均检测到AA、AB两种基因型,大足黑山羊AA和AB基因型频率分别为0.767和0.233,A、B基因频率为0.883、0.117,He、Ne和PIC分别为0.207、0.667和0.333；南江黄羊AA和AB基因型频率分别为和0.833和0.167,A、B基因频率为0.883和0.117,He、Ne和PIC分别为0.193、1.386和0.204,符合Hardy-Weinberg遗传平衡。