食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点,在各种食品安全事件中,病原菌的污染是引起食源性疾病的主要因素之一,快速检测食品中病原菌是及时有效预防病原菌传播及食品中毒的重要前提。常见的食源性致病菌主要有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单核增生李斯特氏菌、致泻性大肠杆菌、变形杆菌等。目前,食品中致病菌的检测主要采用传统的细菌学培养方法,其操作繁琐,检测时间较长,通常需要4-7d才能完成,且灵敏度较低。近年来,PCR针对某一种或一类致病菌的检验方法被建立起来,但是一旦检测的方向有误就会造成时间和药品的浪费,急需建立一种快速有效且通量较高的检测方法。因此,多重PCR作为一种可同时检测多种病原菌的方法发展十分迅速。本研究建立了志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌的多重PCR技术,根据志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、沙门氏菌的侵染性质粒抗原B基因ipaB、变形杆菌的atpD基因设计了三对特异性引物,进行多重PCR反应,实现了对三种食源性致病菌的同时检测。试验过程中对多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子添加量、dNTPmixture添加量及退火温度和Taq酶的添加量等影响要素进行优化,确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序,其反应体系为:10×Buffer 2.5μL,50mM Mg2+ 1μL,2.5 mM dNTP 1μL,10μM的上下游引物各1μL,5 U/μL Taq酶0.3μL,双蒸水补足至25μL;多重PCR扩增程序为:95℃预变性5 min,94℃变性45 s,56℃退火45 s,72℃延伸45 s,30个循环,72℃终延伸10 min,反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果。对多重PCR扩增产物进行了克隆和DNA测序,登录Genebank将测序结果进行网上blast,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究共检测了15株菌,2株志贺氏菌、4株沙门氏菌、2株变形杆菌均为阳性结果;7株其它肠杆菌均为阴性结果,从而验证多重PCR引物特异性。将三种致病菌混合,分别加入1对,2对和3对引物进行扩增,均能够准确检测出结果,因此该多重PCR反应特异性较强。本方法对三种食源性致病菌的纯菌培养物单菌检测灵敏度为志贺氏菌102CFU/ml、沙门氏菌101 CFU/ml、变形杆菌102 CFU/ml;同时检测三种食源性致病菌的灵敏度为志贺氏菌102 CFU/ml、沙门氏菌102 CFU/ml、变形杆菌102 CFU/ml。本方法使用试剂盒处理样品,再通过多重PCR方法同时检测人工污染猪肉中三种致病菌,志贺氏菌检出限为102 CFU/ml、沙门氏菌检出限为103 CFU/ml、变形杆菌检出限102 CFU/ml。并且检测可以在6 h内完成,大大缩短了检测时间。为多重PCR快速检测食品中三种食源性致病菌构建了一个技术平台。