第一部分全外显子测序筛选先天性巨结肠候选致病基因目的:收集先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease,HSCR）患儿及健康儿童外周血进行全外显子测序（Whole exome sequencing,WES）,通过生物信息学分析筛选得到候选致病基因。方法:收集107例HSCR患儿及133例健康儿童的外周血标本,利用DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA,利用Illumina二代测序平台进行WES,通过数据分析及生物信息学预测得到新的HSCR候选致病基因。结果:107例HSCR患儿及133例正常儿童外周血抽取DNA后质量和浓度合格,并进行WES。通过b.collapse test、VT以及SKAT-O三种算法进行case-control分析,初步得到62个候选致病基因,结合GEO数据库小鼠肠神经嵴细胞数据集GSE34208进一步分析,将候选基因缩小到11个。结论:WES测序质量合格,除了RET基因外,分析筛选出GPSM1、MAST1、PSD3、AGBL5、ASPH、GNPTAB、HIRIP3、VPS16、SGSM1、EMB 10个新的未见报道的候选致病基因。第二部分候选致病基因PSD3、VPS16及EMB的初步验证目的:检测Psd3、Vps16及Emb在小鼠肠道发育不同时期的表达量。以斑马鱼为模型,敲低候选致病基因,观察斑马鱼肠神经系统（Enteric Nervous System,ENS）发育。方法:收集C57BL/6J野生型（Wild Type,WT）小鼠不同发育时期肠道组织,通过RTq PCR实验检测Psd3、Vps16及Emb的表达。通过Morpholinos注射在斑马鱼体内敲低psd3、vps16及emb基因的表达。收集5dpf斑马鱼胚胎进行免疫荧光检测。观察斑马鱼肠神经元数量的变化。结果:Psd3、Vps16及Emb在小鼠胚胎各时期均有表达,且出生后表达量较高,然后逐渐减少,到6w时趋于稳定。斑马鱼在psd3及vps16敲低后,肠神经元数目未发生明显变化,而emb敲低后,斑马鱼肠神经元数目减少。HSCR组中有8名患儿携带EMB突变,Sanger测序确定其中7种突变类型。其中6种突变类型可被多种预测软件预测为致病性突变。结论:emb基因的缺失导致斑马鱼ENS发育障碍,肠道神经元缺失。第三部分斑马鱼emb敲除模型的构建及其对肠神经系统发育的影响目的:我们在前期候选致病基因的基础上,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立斑马鱼emb基因敲除模型,并对其ENS的发育进行细致的研究,为进一步探索emb基因对ENS发育的影响奠定基础。方法:利用CRISPR/Cas9技术得到emb斑马鱼敲除模型,免疫荧光技术检测斑马鱼胚胎5dpf及7dpf时期Hu C/D表达情况,观察肠神经元数目变化。对7dpf斑马鱼喂食荧光饲料,在进食后1h、3h和6h分别进行拍摄,观察肠道蠕动功能。原位杂交技术检测突变体和野生型斑马鱼胚胎不同时期的神经嵴细胞标志crestin。免疫荧光检测5-HT表达水平。TUNEL法检测胚胎凋亡信号。结果:通过CRISPR/Cas9技术得到了emb基因敲除的斑马鱼模型。emb在斑马鱼胚胎早期表达量较高,然后逐渐下降趋于稳定。emb主要表达在斑马鱼脑区及肠道组织。emb-/-突变体较WT和杂合子相比,在7-14dpf的过程中,死亡率明显增高。肠神经元染色发现emb-/-突变体的肠神经元数目较杂合子及WT明显减少,且远端神经元缺失。肠道传输功能实验表明,emb-/-突变体的肠道蠕动功能明显减弱。原位杂交染色发现emb-/-突变体crestin表达减少,免疫荧光染色发现emb-/-突变体肠道5-HT的表达明显减少。emb-/-突变体胚胎凋亡信号与WT斑马鱼相比,无明显差异。结论:emb基因参与调控斑马鱼ENS的发育,缺失后可导致斑马鱼肠神经元缺失、肠道蠕动功能异常。第四部分emb参与斑马鱼肠神经系统发育过程的机制探讨目的:探索emb基因敲除后影响斑马鱼ENS发育的信号通路。方法:收集5dpf突变体及WT斑马鱼胚胎,进行转录组测序。分析数据,筛选差异表达基因,进行GO、KEGG富集分析。Western blot检测PI3K/AKT信号通路的变化情况。PI3K及AKT激动剂分别加入胚胎培养,检测刺激后信号通路表达变化情况,同时进行肠神经元染色及增殖信号检测。结果:转录组分析结果发现emb敲除后PI3K/AKT信号通路被抑制。Western blot检测emb-/-突变体中p-PI3K和p-AKT的蛋白水平和WT相比,明显下降,p<0.01。PI3K激动剂刺激后,p-PI3K及p-AKT蛋白水平明显的上调,而AKT激动剂刺激后,pAKT蛋白水平明显升高。两种激动剂刺激后,emb-/-突变体中的肠神经元数目及增殖信号有明显的恢复。结论:emb基因通过PI3K/AKT信号通路影响斑马鱼ENS的发育。