【摘 要】
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G蛋白偶联受体39（GPR39）,是一种锌离子敏感受体,它能感知细胞外锌离子（Zn2+）的变化,介导Zn2+的信号传递,并参与调控生物体内众多的生理活动。例如,促进上皮细胞的增殖与分化,调节离子转运等。近年来,随着研究的深入,GPR39的结构和功能被逐渐挖掘,其在胃肠道、神经系统、骨骼等组织中的作用引发越来越多的关注。产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia Col
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目“锌离子在产肠毒素大肠杆菌F4ac感染中的免疫调控作用研究”（编号:32072820）； 国家自然青年科学基金项目“锌离子在产肠毒素大肠杆菌F4ac菌毛及其受体猪氨肽酶N互作中的调控作用研究”（编号:31702242）；
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G蛋白偶联受体39（GPR39）,是一种锌离子敏感受体,它能感知细胞外锌离子（Zn2+）的变化,介导Zn2+的信号传递,并参与调控生物体内众多的生理活动。例如,促进上皮细胞的增殖与分化,调节离子转运等。近年来,随着研究的深入,GPR39的结构和功能被逐渐挖掘,其在胃肠道、神经系统、骨骼等组织中的作用引发越来越多的关注。产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia Coli,ETEC）是导致人类和幼畜腹泻的重要病原体,其引起的新生及断奶仔猪腹泻发病率较高,能够给养猪业造成巨大的经济损失。前期研究发现,ETECF4ac感染IPEC-J2细胞后会诱导细胞凋亡。有报道称,GPR39可以在神经细胞、巨噬细胞中抑制不良刺激引起的细胞凋亡。那么GPR39是否能够抑制F4ac感染所引起的肠道细胞凋亡?为了验证这一假设,本研究探索了GPR39对F4ac诱导仔猪肠道细胞凋亡的影响,以期进一步阐明F4ac的致病机理,为F4ac的预防和治疗提供新思路。同时,本研究首次探索了不同Zn2+浓度条件下,Zn2+结合位点对GPR39功能的影响,为进一步研究GPR39的功能奠定基础。研究一 为了进一步研究GPR39的结构和功能,根据GenBank上猪GPR39 mRNA序列设计合成特异性引物,提取猪肠道组织的RNA,并以反转录获得的cDNA为模板,PCR扩增GPR39-C端基因片段,构建原核表达系统。重组质粒测序和酶切结果显示,GPR39-C端基因已正确插入pET28a（+）原核表达载体;SDS-PAGE结果证明重组蛋白为包涵体,且纯化产物在20 kDa处有目的蛋白条带出现;ELISA和Western blot结果显示,成功制备GPR39-C端蛋白的多克隆抗体。GPR39-C端蛋白的成功表达和多克隆抗体的成功制备,为进一步探索GPR39的功能奠定了基础。研究二 为了探索不同浓度Zn2+对GPR39基因表达量的影响,根据GenBank上猪GPR39 mRNA序列设计合成特异性引物,提取猪肠道组织RNA,并反转录成cDNA第一链,RT-PCR扩增猪GPR39全长基因,构建pcDNA3.1-3flag-GPR39重组质粒。之后将重组质粒中GPR39的Zn2+结合位点进行定点突变。pcDNA3.1-3flag-GPR39及其突变体质粒瞬时转染至IPEC-J2细胞后,加入不同浓度的Zn2+进行刺激,通过实时荧光定量PCR检测GPR39的基因表达。重组质粒测序和酶切结果显示,GPR39基因已正确插入pcDNA3.1-3flag载体中;重组质粒测序和琼脂糖凝胶电泳结果显示,重组质粒中GPR39的Zn2+结合位点已被成功突变;荧光定量结果显示,25 μM Zn2+能够较好的刺激IPEC-J2细胞中GPR39的基因表达,且Zn2+关键位点的突变使GPR39丧失了感知Zn2+刺激的能力,同时His17位点可能在GPR39感知Zn2+浓度变化中更为重要。研究三 为了探索GPR39在F4ac诱导仔猪肠道细胞凋亡中的功能,将pcDNA3.1-3flag-GPR39及其Zn2+结合位点突变体质粒转染到IPEC-J2细胞中,构建稳定表达细胞系;在有无TC-G 1008刺激和有无F4ac感染条件下,测定稳定细胞系中cAMP、cGMP的含量和CERB、SRE的活性,以及细胞中凋亡相关基因和蛋白的表达。结果表明:1.成功构建GPR39及其Zn2+结合位点突变的稳定表达细胞系。2.pcDNA3.1-3flag-GPR39-IPEC-J2细胞中表达的GPR39具有生物活性,且可能通过Gα s和Gα 12/13的活化激活下游信号分子,同时Zn2+结合位点的突变会抑制GPR39蛋白的活性。3.GPR39刺激剂TC-G 1008,可以刺激IPEC-J2细胞和GPR39及其突变体稳定表达细胞中GPR39的基因表达,但能抑制GPR39及其突变体稳定表达细胞中GPR39的活性。4.在F4ac感染条件下,GPR39能够在一定程度上抑制细胞凋亡。5.Zn2+结合位点突变后,与正常GPR39相比,GPR39突变体倾向于促进F4ac诱导的肠道细胞凋亡,但凋亡相关蛋白的表达情况还需进一步验证。
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