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稻瘟菌激活蛋白PemG1是从稻瘟菌(Magnaporthe griesea)中分离的一种蛋白激发子,具有诱导植物抗病、促进植物生长的活性。目前,激活蛋白在植物体内的受体蛋白和信号传导途径成为研究的热点。本文利用酵母双杂交系统和噬菌体展示技术筛选PemG1的互作蛋白和活性多肽,并对互作蛋白进行受体特征分析,主要研究结果如下:1.酵母双杂交LexA系统筛选:将稻瘟菌激活蛋白基因pemG1克隆到诱饵质粒载体pLexA上,构建DNA-BD融合载体pLexA-pemG1表达诱饵蛋白,将该重组诱饵质粒pLexA- pemG1转入酵母菌株EGY48[p8op-lacZ]中发现无自激活报告基因作用,对酵母细胞也无毒性。进一步顺序转化,筛选克隆在pB42AD载体上的番茄cDNA文库,通过诱导培养基(SD/Raf/Gal/-His/-Trp/-Leu/-Ura / X-Gal + BU salts)进行互作蛋白的筛选,排除假阳性,最终获得了十组互作蛋白,对这些互作蛋白进行NCBI BLAST比对,分析推导出互作蛋白MGIP-18具有二次跨膜的结构特征,我们认为它可能是PemG1的蛋白受体。2.酵母双杂交GAL4系统筛选:将基因pemG1克隆到诱饵质粒载体pGBKT7上构建DNA-BD融合载体pGBKT7- pemG1,转化酵母AH109,检测无自激活作用和细胞毒性。利用SMART? cDNA合成技术,首先用Tri-zol提取水稻总RNA,然后反转录PCR和长距离PCR制备含有同源重组位点SMART III和CDS III序列的水稻ds cDNA;共转化重组诱饵载体pGBKT7- pemG1、Sma I线性化的文库载体pGADT7-Rec和SMART?技术合成的ds cDNA ,在四缺培养基( SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X ?α-Gal)上,筛选得到互作蛋白MGIP 4-1(或MGIP 4-6),它与热激蛋白DnaJ高度同源。热激蛋白DnaJ作为分子伴侣参与翻译后修饰、蛋白质折叠等过程,并且调节受体与配体的结合。3.噬菌体展示技术淘洗:利用纯化的PemG1蛋白作为抗原包被免疫管,再用噬菌体十五肽库亲和吸附,经过低PH溶液洗脱并进行噬菌体的扩繁。四轮“吸附-洗脱-扩增”的富集淘洗后,随机挑选90个克隆,进行ELISA反应,测定OD450的吸光值,挑选阳性克隆并测序,比对分析得到了线粒体内膜电子传递链上的NADH脱氢酶的两个亚基多肽序列B2,C2(或D2),以及DnaJ族热激蛋白的J结构域的结合位点序列D3(或E2)。4.结构功能分析:作为受体蛋白,通常与配体分子结合,具有跨膜的分布结构,参与配体分子介导的信号传导过程。通过结构功能分析表明互作蛋白MGIP-18具有受体蛋白特征;酵母双杂交GAL4系统的筛选结果分析推导出互作蛋白MGIP 4-1(或MGIP 4-6)具有调节受体与配体结合的功能。