恶性肿瘤因早期筛查难、治愈率低且复发率高,对人类生命健康产生了巨大的威胁。肿瘤细胞会分泌一些生物分子,可用于特异性与正常细胞进行区分,从而实现肿瘤的早期诊断。此外,在肿瘤发展及治疗过程中会释放出大量的信号分子,指示肿瘤的发生、发展进程和治疗效果。因此,开发肿瘤的早期筛查方法及信号分子的监测探针,有利于实现肿瘤细胞的早期诊断、发展进程监控和实时制定肿瘤治疗个性化方案。医学研究中,已经开发许多成像技术用于监测与获取肿瘤信息,包括如X射线断层扫描、磁共振及超声等影像技术,但这些技术无法在分子水平上实现对肿瘤细胞中多分子信息与生理病理过程进行实时监测。荧光分子成像可在分子水平上实现多个靶物的同时监测,实时获取肿瘤细胞分子信息。但构建制备简单、生物相容性好、灵敏和准确的分子荧光成像探针是关键的步骤。近年来,已开发许多用于肿瘤细胞荧光成像分析的探针,但依然存在分析靶标信息单一、检测灵敏度低以及获取信息不可靠等问题。DNA纳米探针具有生物相容性好、可编程性高以及可控修饰等优势,已被广泛用于肿瘤细胞成像分析。特别是DNA逻辑纳米器件以细胞中多个分子作为输入,通过逻辑运算对信息进行处理,具有获取信息准确度高的优势,已在肿瘤细胞成像分析中得到了广泛关注。但现有研究仍存在以下三方面问题:（1）逻辑输入信息层次和维度单一,检测灵敏度低,导致获取信息准确度不够;（2）大多数DNA逻辑纳米器件中各元件易扩散,导致逻辑运算速度较慢;（3）已有研究对特定区域的精准成像分析较少,细胞空间选择性差,无法实现对特定生理病理过程进行监控。基于此,本论文以提高DNA逻辑纳米器件的灵敏度、准确度、计算速度及细胞空间选择性等性能为目标,制备新型DNA逻辑纳米器件,并将其应用于肿瘤细胞空间选择性成像分析,包括以下三个方面:1.限域效应的DNA逻辑纳米器件用于跨膜癌症标志物的顺序成像已有研究表明,生物标志物在肿瘤细胞中显示出不同的空间分布,因此监测活细胞多个不同空间分布的癌症标志物,对获取肿瘤细胞类型的多维精确信息是至关重要。在此项研究中,以DNA四面体为载体,通过用MUC1-apt适配体锁住H1的toehold形成H1-MUC1-apt双链结构,构建了集成限域效应的DNA与门逻辑纳米器件,用于肿瘤细胞膜上黏蛋白1（Mucins 1,MUC1）和细胞质中micro RNA-21（miR-21）的跨膜顺序成像分析,以实现对肿瘤细胞的精准识别。结果表明,只有细胞膜表面表达MUC1的情况下,MUC1-apt才会从H1-MUC1-apt双链中脱落释放出Cy5的荧光信号,并暴露出H1中与miR-21特异性结合的toehold,实现MUC1作为识别miR-21的开关减少电路泄漏。该纳米器件进入细胞后,由细胞内miR-21启动H1和H2之间的催化发卡组装（Catalytic hairpin assembly,CHA）反应,输出Cy3信号,最终完成对细胞膜表面蛋白MUC1和细胞质中miR-21的与门顺序逻辑响应,显著提高检测准确度。DNA四面体的空间限域效应显著提高了H1和H2之间的反应速度和效率,因此该纳米器件对miR-21识别速度快且检测灵敏度高。最终实现了肿瘤细胞中多维生物标志物的准确、快速和灵敏跨膜顺序成像分析,对肿瘤细胞类型进行了精准区分。2.智能DNA逻辑纳米器件用于溶酶体内H+/ATP的动态成像在第1项研究工作中,DNA逻辑纳米器件存在负载量低的问题,与其它报道的DNA逻辑纳米器件一样,在亚细胞水平上进行逻辑操作仍面临着很大的挑战。基于此,该项工作将酸响应的i-motif序列（T1）、ATP适配体（T2）和含SH修饰的连接链（L）杂交形成Y型DNA结构（Y-DNA）,通过Au-S键将其高效负载到金纳米颗粒（Gold nanoparticles,AuNPs）表面,构建用于溶酶体内H+/ATP选择性成像分析的DNA逻辑纳米器件。结果表明,该纳米器件细胞内化后,在溶酶体的酸性介质中T1链折叠并形成i-motif结构,高浓度的ATP将与T2产生特异性结合,输出由Cy3到Cy5之间荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）信号,实现了对溶酶体中H+/ATP的动态成像。本研究将多重能量转移和与门逻辑运算整合到AuNPs中形成一体化逻辑纳米器件,具有降低背景信号、减少假阳性信号泄露以及提高多靶物检测的逻辑运算速度的优势,实现了细胞器水平的DNA逻辑操作,有望用于验证自噬激活剂在免疫原性细胞死亡治疗过程中的免疫增强作用及溶酶体相关细胞疾病诊断等。3.多功能DNA逻辑纳米器件用于凋亡过程中线粒体内micro RNA的实时监测在第2项研究工作中,DNA逻辑纳米器件存在对亚细胞器中物质分子检测灵敏度低等问题。同时,对凋亡过程中线粒体内多种micro RNA（miRNA）的实时监测研究较少。在此基础上,该项工作以DNA纳米球为载体,将其两条骨架链延长,用于高效编码能够对多靶物循环的发卡H1和H2,并修饰线粒体靶向配体三苯基膦,从而构建集成多靶物循环与线粒体靶向功能的DNA逻辑纳米器件。结果表明,该纳米器件进入细胞后,肿瘤细胞同时表达miR-21和miR-10b时,才启动H1和H2之间CHA反应,输出由Cy3到Cy5的能量转移信号,实现了对两种靶物的逻辑控制以及同时循环放大。DNA纳米球结构的空间限制效应,显著增加CHA反应对miR-21和miR-10b响应的速度和灵敏度,提高逻辑运算的速度与效率。借助于三苯基膦的线粒体靶向功能,该纳米器件可以选择性定位于线粒体内,完成了对细胞凋亡过程中线粒体内miR-21和miR-10b水平的实时、灵敏及快速监测。综上所述,本研究主要利用DNA纳米结构的可编程性和多级输入,构建DNA逻辑纳米器件对肿瘤细胞空间选择性成像,以获取肿瘤细胞中精确、多维信息。因而就此解决了以下问题,首先以DNA四面体为集成载体,构建集成信号放大和多级逻辑输入功能的DNA逻辑纳米器件,用于跨膜癌症标志物MUC1和miR-21的顺序成像分析,实现对肿瘤细胞的精准诊断。为提高负载效率,进一步以AuNPs为载体,在其表面高效负酸响应的i-motif和ATP适配体序列,构建DNA逻辑纳米器件,实现对溶酶体内H+/ATP的动态监测,初步构建了细胞器水平的DNA逻辑操作调控。为进一步实现亚细胞器定位及高空间选择性多靶物灵敏成像,在DNA纳米球上高效编码多靶物循环的CHA反应发卡,对miR-21和miR-10b的循环放大并提高逻辑运算速度,实时监测了肿瘤细胞凋亡过程中线粒体内miR-21和miR-10b,对细胞凋亡机制研究和癌症治疗方案的优化有重大意义。