世界柑橘业发展迅速,2019年柑橘年产量已达1.58亿吨,尤以甜橙（Citrus sinensis）产量最高,约占一半。除小部分用于鲜食外,绝大多数甜橙都被用于生产橙汁、果酱和果脯等产品。锦橙（C.sinensis Osbeck）是大量种植于中国川渝地区的柑橘亚种,因皮薄肉多、酸甜适中、味浓多汁和几乎无核等特点被广泛用于生产各种加工产品。然而,锦橙在加工过程中会产生大量副产物,尤其是果皮,可占果实原料质量的25～40%,这些果皮大多都被直接丢弃,造成严重的资源浪费和环境污染。柑橘果皮富含多种生物活性成分,其中很多黄烷酮、多甲氧基黄酮（Polymethoxyflavonoids,PMFs）和辛弗林等,目前只在或主要在柑橘属植物中发现,且在果皮中的含量远远高于果肉。近年来许多研究表明,这些活性成分的生物合成,可被多种（非）生物激发子诱导加强,其中,应用有益的微生物激发子（Microbial elicitors,MEs）与作物伴生,诱导和促进宿主功能成分的积累,可获得更高品质和商业价值的农产品。此法安全高效,绿色环保,被公认为是最有希望取代化学药剂、最能实现环境保护和可持续发展的新型农业技术之一。荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）ZX是本课题组保存的一株具有极高生防潜力的拮抗菌,采后接种能通过多种方式显著抑制锦橙果实的青霉病和绿霉病腐烂,其中诱导果实抗性是其发挥生防作用的重要机制之一;而采前喷施也可有效诱导采后锦橙果实的抗病性,由此可见,该菌株具有作为ME的潜力。然而,采前施用P.fluorescens ZX是否能诱导提高锦橙果皮中活性成分的积累量,尚不清楚。基于此,本试验首先从全基因组序列（Whole genome sequencing,WGS）角度明确了P.fluorescens ZX的生物学特性,而后在“北碚447”锦橙的生长发育期间喷施不同次数的P.fluorescens ZX菌悬液,探究P.fluorescens ZX采前处理对锦橙果皮中主要生物活性成分尤其是酚类化合物的诱导积累效应及可能的作用机制,以期为提高果皮中功能成分的含量、加强废弃果皮的综合利用和增加农产品的附加值提供理论依据。主要研究结果如下:1、P.fluorescens ZX全基因组测序及其安全性评价通过全基因组测序获得了P.fluorescens ZX的精细基因图谱。P.fluorescens ZX-WGS大小约为6.39 Mb,鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率（GC含量）为59.72%,共预测到5865个编码基因,其中与分子功能和代谢相关的基因数目最多,暗示该菌株代谢旺盛、环境适应力强。系统发育树和共线性分析表明,P.fluorescens ZX与菌株Pseudomonas sp.DSM 29164的亲缘关系最近,与偶氮假单胞菌（P.azotoformans）的共线性更高;同源基因分析显示,P.fluorescens ZX与选取的15株近缘菌株的共有基因为3204个,独有基因高达2470个,说明P.fluorescens ZX具有较高的特异性。同时,P.fluorescens ZX-WGS中含有大量与氨基酸、小分子碳水化合物、高碳聚合物、嗜铁素、抗生素、防御酶、抗氧化剂、鞭毛、纤毛和生物膜等组成、合成/形成、分解、代谢相关的基因,暗示P.fluorescens ZX具有多重的生存策略、顽强的生命力和优良的定殖能力,有作为ME的潜力。此外,P.fluorescens ZX不是植物致病菌,不会引起拟南芥过敏性坏死反应,也不能产生溶血素,安全性较高,可放心施用于田间。2、P.fluorescens ZX采前喷施对锦橙果皮中主要活性成分及果实品质的影响在果实的不同生长期喷施不同次数的P.fluorescens ZX菌悬液,考察成熟期锦橙果皮中初生代谢产物和主要活性成分对P.fluorescens ZX的响应变化,同时监测了P.fluorescens ZX采前处理对果实品质的影响。试验结果显示,P.fluorescens ZX采前处理对果皮中的初生和次生代谢产物均有显著影响（P＜0.05）,主要表现为:和空白对照（Control checks,CK）相比,P.fluorescens ZX采前喷施次数较少时,果皮中的很多初生代谢产物,如葡萄糖、果糖、肌醇、粘肌醇、肌糖、岩藻糖、半乳糖、赤藓酮糖、甘油、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、苹果酸、丙酮酸、柠檬酸、草酰乙酸、奎宁酸、精氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丙氨酸等的含量显著上升（P＜0.05）,而次生代谢产物的含量相对变化较小;当P.fluorescens ZX采前喷施次数达到4次时,许多初生代谢产物的含量反而急剧下降;叶绿素、柠檬苦素和诺米林等的含量也显著降低（P＜0.05）,而可溶性酚、不可溶性酚（Insoluble bound phenols,IBPs）、类黄酮、辛弗林、精油、水溶性果胶和原果胶等的积累量显著提高（P＜0.05）,较CK分别上升了约26.9%、21.6%、39.6%、19.7%、45.4%、33.0%和20.7%。同时,P.fluorescens ZX采前处理不仅不会对果实品质造成负面影响,反而在香气、滋味和一些营养成分等方面有效提高了果实的品质,显著提高（P＜0.05）了果肉中可溶性固形物、可溶性总糖、可滴定酸和抗坏血酸等的水平及果皮中柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯和芳樟醇等的含量。3、P.fluorescens ZX采前喷施对锦橙果皮中酚类物质的影响分别利用超高效液相色谱（Ultra-high performance liquid chromatography,UHPLC）-四极杆飞行时间质谱和UHPLC-二极管阵列检测器对不同生长期（幼果期、膨大期、第一次转色期、第二次转色期和成熟期）和不同采前处理的锦橙果皮油胞层和白皮层中各种存在形式的酚类化合物进行了定性和定量分析,并利用实时定量聚合酶链反应监测了苯丙烷途径（Phenylpropanoid pathway,PPP）上关键基因的表达水平。结果表明,P.fluorescens ZX采前处理对锦橙果皮中酚酸和类黄酮的存在形式、成分组成和含量及PPP上关键基因的表达水平均具有显著影响（P＜0.05）,且深受果实生长期、组织部位和采前喷施次数等因素的影响而差别很大。定性分析共鉴定出55种酚类物质,包括6种苯甲酸型酚酸（Hydroxybenzoic acids,HBAs）、4种肉桂酸型酚酸（Hydroxycinnamic acids,HCAs）、8种黄烷酮、27种黄酮（包括20种PMFs）、6种黄酮醇和4种其他类别的物质。接着定量分析了果皮中主要的23种酚类化合物,包括4种HBAs（苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸和丁香酸）、4种HCAs（咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸和芥子酸）、6种黄烷酮（柚皮素、柚皮苷、橙皮素、橙皮苷、新橙皮苷和香风草甙）、7种黄酮（芹菜苷、野漆树苷、维采宁-2、木犀草素、甜橙黄酮、橘皮素和川陈皮素）和2种黄烷酮（槲皮素和芦丁）。结果显示,酚酸的存在形式更为多样,在油胞层和白皮层的游离酚（Free phenols,FPs）、酯型结合酚（Esterified bound phenols,EBPs）、糖苷型结合酚（Glycosylated bound phenols,GBPs）和IBPs中基本上均有检出,但主要在EBPs中大量分布;而类黄酮仅在FPs、EBPs和GBPs中检出,黄烷酮和黄酮主要以GBPs的形式存在,橙皮苷和PMFs则在FPs中占有绝对含量。与白皮层相比,油胞层中含有更多形式和更高含量的HCAs、黄酮和PMFs;而白皮层中的黄烷酮,特别是GBPs-黄烷酮的含量则显著高于（P＜0.05）油胞层;HBAs和黄酮醇在2种组织中的总含量则无显著性差异。总的来说,P.fluorescens ZX采前处理显著上调（P＜0.05）了PPP上许多关键基因的表达,从而显著提高（P＜0.05）了多种酚酸和类黄酮的积累量,且这种诱导积累效应随着喷施次数的增多而总体上呈现出渐次增强的趋势,尤其是在果皮中占绝对优势含量的FPs-橙皮苷、FPs-甜橙黄酮、FPs-川陈皮素、EBPs-阿魏酸、EBPs-对香豆酸和GBPs-橙皮素等物质,其含量在P.fluorescens ZX采前喷施4次的成熟期油胞层中分别约是CK的1.6、1.3、1.3、1.1、1.2和1.6倍。4、基于组学策略初步解析P.fluorescens ZX采前喷施调控锦橙果皮物质代谢的生物学机制选取具有代表性的膨大期和成熟期的油胞层样本,采用Illumina Miseq高通量测序和转录组测序等技术,探究P.fluorescens ZX采前喷施处理对锦橙果皮油胞层中细菌和真菌多样性的影响,并利用趋势分析和权重基因共表达网络分析初步解析了P.fluorescens ZX采前处理调控果皮物质代谢的生物学机制。结果显示,P.fluorescens ZX采前喷施对锦橙果实油胞层的细菌和真菌的Alpha多样性没有显著影响,但会显著改变（P＜0.05）微生物群落的组成和结构,引起寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、Paramycosphaerella和乌氏霉属（Uwebraunia）等的丰度显著上升（P＜0.05）,并显著降低（P＜0.05）了常见的几种病害真菌如青霉属（Penicillium）和刺盘孢属（Colletotrichum）等的丰度。转录组测序结果表明,P.fluorescens ZX采前喷施在果实膨大期对油胞层的初生代谢和次生代谢均有显著影响（P＜0.05）,显著差异基因富集的pathway与许多初生代谢产物（如糖类和脂类等）和次生代谢产物（如硫代葡萄糖苷、类黄酮和萜类等）均密切相关;而在成熟期则主要作用于次生代谢途径,尤其是代谢途径和苯丙烷生物合成。通过对与信号分子和植物激素合成、代谢及信号转导途径上相关基因表达水平的分析,推测P.fluorescens ZX主要是通过乙烯/茉莉酸信号转导途径参与和调控油胞层的基因表达和物质代谢的,同时多种植物激素尤其是生长素、油菜素内酯、赤霉素等参与了该生物过程。在重点关注的酚类化合物的代谢方面,P.fluorescens ZX采前处理显著上调（P＜0.05）了PPP和类黄酮生物合成途径上多个相关基因的表达,且总体上对这些基因的诱导效应随着喷施次数的增多而呈现显著增强（P＜0.05）的趋势。在膨大期,P.fluorescens ZX采前处理影响最显著的核心通路是代谢途径（ko01100）,响应最激烈的基因是Cs＿ont＿5g017430（COMT1）;而在与成熟期样本酚类物质含量（性状数据）密切相关的2个模块orange和pink中,分别筛得21个和7个核心基因,其中Cs＿ont＿1g009820（4CL2）和Cs＿ont＿1g011170（CCR1）可能是关键调控基因。上述试验结果表明:P.fluorescens ZX可用作一种绿色安全、高效环保的作物接种剂,采前喷施能通过调控锦橙果实微生物群落组成和相关基因的表达,有效提高果实中一些营养物质和香气成分的含量,同时显著促进果皮中多种活性成分的积累。从生理生化反应和基因表达水平两方面推断,少次数的P.fluorescens ZX采前喷施处理主要促进锦橙果皮的初生代谢,使得初生代谢产物大量积累;多次数的采前处理可能同时刺激果皮的初生代谢和次生代谢,并强烈诱使初生代谢产物生物合成次生代谢产物。因此,采前多次喷施P.fluorescens ZX是提高果实品质、调控果皮物质代谢、诱导次生代谢物质尤其是HCAs、黄烷酮、PMFs、精油、辛弗林和果胶等功能成分积累的有效途径。