研究背景与目的纵观全球,在妇科恶性肿瘤中,子宫颈癌是最多见的威胁女性生命康健的疾病。流行病学研究表明,此病患病多发岁数根据期别不同而呈现不同的阶段,浸润癌在50-55岁,原位癌是30-35岁。子宫颈癌早期通常并不会有症状,达到晚期时可能有不正常的阴道出血、骨盆腔疼痛或性交疼痛。大量研究证明,本病的发生与HPV(人乳头瘤病毒)感染、性行为及分娩次数、抽烟、使用避孕药、免疫不全等风险因素相关,其中高危型HPV侵袭为首要易感因子。近40年源于宫颈刮片TCT的广泛开展,宫颈病变得以早期发现和治疗,对控制宫颈癌发病率和死亡率成效显著。然而粗略计算,全世界每一年会出现50万新发的宫颈癌病人,发展中国家占绝大多数。我国仍然属于发展中国家,因为人口庞大、经济相对落后、国民医疗知识缺乏、性观念逐渐开放以及人HPV感染,我国宫颈癌的发病率近20年以来呈上涨趋势,而且病发年龄逐渐年轻化,每一年新增患病人数约130,000,约50,000人死于宫颈癌。子宫颈癌具体的病因及致病机制目前仍不清楚,因此如何预防宫颈癌发生及提高患者治愈率亟待解决。传统治疗方式为手术联合放化疗,但这种方式对患者的损伤大,治疗后患者生活质量明显下降,很难令人满意。因此寻找一种全新的治疗方式将成为未来宫颈癌治疗的关键。近年来,越来越多的学者将预防及治疗恶性肿瘤的方式定位于分子及基因水平上。大量实验报道信号通路的异常活化在宫颈癌的发病过程中占据举足轻重的地位,其中JAK/STAT途径越来越受到人们的关注。JAK-STAT信号传导通路在调节细胞存活、增殖及分化中起着至关重要的作用；同时在基因水平上,其将许多细胞因子及生长因子传递到细胞核内以调节基因的表达。在促进肿瘤发生发展的过程中,该通路的异常表达及活化占有举足轻重的地位,是介入治疗人类各种肿瘤有效的分子靶点之一。JAK-STAT通路过度活化的同时激活其负向调节环路而精确地介导细胞及生长因子等活性物质,使该途径保持动态平衡。近年来,相关研究表明在JAK-STAT转导途径的负反馈环路中起码有三种抑制蛋白：SOCS家族：PTP家族,如SHP-1,2; PIAS家族。目前,SOCS3是SOCS家族中研究最为广泛和深入的分子。SOCS3作为SOCS家族的重要分子在生理状态下通常不表达或低表达,JAK/STAT信号传导过度激活可以诱导其表达,之后SOCS3结构中的SH2区域结合磷酸化的酪氨酸反过来减少STATs的激活和JAKs激酶的活性,形成负反馈环,从而维持此信号传导的平衡。研究表明,SOCS3在多种肿瘤中可发挥积极的抑制作用,因此其在妇科肿瘤中的作用也备受重视。基于分子技术的持续发展,同时伴随着对SOCS3研究的深入,未来在宫颈癌诊断、治疗及预测预后方面,SOCS3可能成为分子生物标志物以及有效干预的分子靶点。在宫颈癌发病过程中,是不是可以改变SOCS3的表达进而调节JAK-STAT传导途径的异常活化,从而改变宫颈癌的预后,甚至治愈宫颈癌,这些问题都有待进一步探讨。利用一小段序列特异的双链RNA降解与其具有同源性的信使RNA,从而发生靶基因PTGS现象,这一过程称为RNA干扰。实现RNAi功效必不可少的因子就是小干扰RNA,其在特定的RNA沉默过程中占据中央位置,是降解目标信使RNA (Messenger RNA, mRNA)的主导因素。本研究利用小干扰RNA为工具,应用pLKO.1作为载体构建针对人SOCS3基因的慢病毒表达载体,以病毒为媒介沉默人宫颈癌细胞株中的SOCS3,用于研究SOCS3的表达与宫颈癌的相关性,为研究肿瘤的预防及治疗奠定基础。方法根据Genbank中SOCS-3基因cDNA序列及特点,结合小干扰RNA构建原则及pLKO.1慢病毒载体的特点,设计上下游引物,由公司合成,之后退火形成双链Oligo (shRNA 01igos)。扩增载体pLKO.1质粒,使用内切酶双酶切并按照胶回收试剂盒操作说明胶回收质粒pLKO.1,根据纯化试剂盒说明纯化双酶切后的质粒产物。再用连接酶将退火形成的双链Oligo与双酶切的空载体连接,之后将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH 5 α,涂板后挑选出阳性单克隆菌落,进行细菌PCR检测初步挑选具有插入片段的阳性重组子,之后扩增含有目的基因的阳性克隆并根据质粒提取说明提取重组质粒PLKo.1-SOCS3-siRNA,保菌后送含有PLKo.1-SOCS3-siRNA重组质粒的E. coli DH 5α大肠杆菌菌液到测序公司测序。结果 1.根据小提试剂盒提取的质粒pLKO.1浓度较高,核酸电泳图未见明显杂带；2.质粒pLKO.1分别经AGE1和EcoRl酶切后的质粒经琼脂糖凝胶电泳检测到大小约为7000bp、1900bp 2个片段,之后胶回收大片段；3.根据GenBank中SOCS3基因设计的siRNA Oligo并将其退火,之后成功连接其与质粒pLKO.1酶切产物,将连接产物成功导入DH 5 α感受态细胞中,之后经PCR初步成功筛选出阳性产物：4.将PCR初步筛选的阳性克隆重组质粒送大连Takara测序,测序结果与GenBank上公布的基因序列完全一致,经测序验证,成功构建了针对靶基因SOCS3的慢病毒载体PlKO.1-SOCS3-siRNA。结论成功合成了靶向人源基因细胞因子信号转导抑制分子-3的重组慢病毒载体SOCS3-pLKO.1-siRNA,为进一步研究SOCS3的表达在肿瘤中的作用以及SOCS3与宫颈癌的相关性奠定基础。