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第一部分实验性自身免疫性心肌炎大鼠模型及程序性坏死、凋亡、自噬的变化目的:建立实验性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmunity myocarditis,EAM)大鼠模型,探索程序性坏死(necroptosis)、凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)在EAM大鼠模型急慢性期中的变化。方法:Lewis大鼠18只,随机分为:对照组(3周)(Control-3W)、对照组(8周)(Control-8W)、自身免疫性心肌炎组(3周)(EAM-3W)和自身免疫性心肌炎组(8周)(EAM-8W)。通过猪心肌肌球蛋白免疫构建EAM大鼠模型。免疫后第3周及8周彩色多普勒检查心功能后进行HE染色;免疫组化、荧光定量PCR、Western blot检测程序性坏死通路RIP1/RIP3/MLKL、凋亡通路Caspase3/Bax/Bcl2、自噬通路LC-3的m RNA表达、蛋白表达情况。结果:(1)免疫后第3周EAM-3W组左室舒张末横径、左室收缩末横径增大(P<0.05),射血分数、短轴缩短率下降(P<0.05)。免疫后第8周EAM-8W组左室舒张末横径增大(P>0.05),左室收缩末横径增大(P<0.05);射血分数、短轴缩短率下降(P<0.05)。(2)免疫后第3周,HE染色示EAM-3W组大鼠心肌细胞变性坏死伴炎性细胞浸润;免疫后第8周,EAM-8W组大鼠心肌细胞变性坏死加重,并可见明显纤维化改变。(3)免疫组化、荧光定量PCR、Western blot检测结果示免疫后第3周及第8周,程序性坏死通路蛋白RIP1/RIP3/MLKL、凋亡通路蛋白caspase-3/Bax/Bcl-2及自噬通路蛋白LC-3主要表达于胞浆,EAM组心肌组织中程序性坏死通路RIP1/RIP3/MLKL、凋亡通路Caspase 3/Bax的m RNA及蛋白表达均增高(P<0.05),凋亡通路中Bcl-2的m RNA及蛋白表达下降(P<0.05)。与对照组相比,自噬通路LC-3II的m RNA在免疫后第3周及第8周表达增加(P<0.05),蛋白表达在第3周增加(P<0.05),在第8周无明显差异(P>0.05)。结论:(1)通过对Lewis大鼠经多点部位注射猪心肌肌球蛋白成功诱导实验性自身免疫性心肌炎大鼠模型。(2)实验性自身免疫性心肌炎大鼠在急慢性期心功能明显下降。(3)程序性坏死、凋亡参与自身免疫性心肌炎大鼠急慢性期进程,自噬可能只参与实验性自身免疫性心肌炎大鼠急性期进程。第二部分程序性坏死、凋亡、自噬拮抗剂对实验性自身免疫性心肌炎大鼠心功能的影响及细胞死亡方式之间的相互关系目的:根据第一部分的实验结果,分别给予抑制剂Nec-1、z VAD-fmk、3-Ma,评估在EAM急性期,程序性坏死、凋亡、自噬拮抗剂对大鼠心功能的影响,探讨不同细胞死亡形式在EAM大鼠急性期中的相互关系。方法:Lewis大鼠29只,随机分成:对照组(Control组)和实验组。实验组随机分为6组:自身免疫性心肌炎组(EAM组)、程序性坏死抑制剂组(EAM+Nec-1组)、凋亡抑制剂组(EAM+z VAD-fmk组),自噬抑制剂组(EAM+3-Ma组),药物对照组(EAM+DMSO组)。实验组构建EAM大鼠模型。初次免疫后第8天分别经腹腔注射Nec-1(0.6mg/kg)、z VAD-fmk(1mg/kg)、3-Ma(15mg/kg)及等剂量0.1%DMSO,1次/天,共2周。免疫后第3周检查心功能后行HE染色、免疫组化;荧光定量PCR、Western blot分别检测程序性坏死通路RIP1/RIP3/MLKL、凋亡通路Caspase 3/Bax/Bcl2、自噬通路LC3的m RNA表达、蛋白表达情况。结果:(1)免疫后第3周EAM组大鼠心功能较Control组明显下降:左室舒张末横径、左室收缩末横径均增大(P<0.05),射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)下降(P<0.05);EAM+DMSO组心功能与EAM组无明显差异(P>0.05);EAM+Nec-1组、EAM+z VAD-fmk组、EAM+3-Ma组较EAM+DMSO组改善,左室舒张末横径、左室收缩末横径均减小(P<0.05),射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)升高(P<0.05)。(2)免疫后第3周,HE染色示EAM组大鼠心肌细胞出现溶解现象伴炎性细胞浸润,炎症积分高于Control组(P<0.05);EAM+DMSO组与EAM组比较无明显差别(P>0.05);EAM+Nec-1组、EAM+z VAD-fmk组、EAM+3-Ma组心肌细胞病理学改变及炎症积分与EAM+DMSO组相比减轻(P<0.05)。(3)免疫组化、荧光定量PCR、Western blot检测结果示免疫后第3周,程序性坏死通路蛋白RIP1/RIP3/MLKL、凋亡通路蛋白caspase-3/Bax/Bcl-2及自噬通路蛋白LC-3主要表达于胞浆,EAM组大鼠心肌组织中RIP1、RIP3、MLKL、LC-3II及Caspase 3的m RNA及蛋白表达均较Control组增高,Bcl2表达量低于Control组(P<0.05),与EAM+DMSO组相比差异无统计学意义(P>0.05)。(4)与EAM+DMSO组相比,EAM+Nec-1组RIP1、RIP3、MLKL、Bcl2的m RNA及蛋白表达下降(P<0.01),Caspase 3、Bax表达增高(P<0.01),LC-3II表达未见明显差异(P>0.05)。(5)与EAM+DMSO组相比,EAM+z VAD-fmk组RIP1、RIP3、MLKL、Bcl2的m RNA及蛋白表达增加(P<0.01),Caspase 3、Bax、LC-3II表达下降(P<0.01)。(6)EAM+3-Ma组RIP1、RIP3、MLKL、Caspase 3、Bax的m RNA及蛋白表达量增加(P<0.01),LC-3II表达下降(P<0.01),Bcl2表达下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)在自身免疫性心肌炎急性期分别抑制程序性坏死、凋亡、自噬进程后,可改善实验性自身免疫性心肌炎大鼠心功能。(2)在自身免疫性心肌炎急性期抑制程序性坏死可以促进凋亡,对自噬无明显影响。(3)在自身免疫性心肌炎急性期抑制凋亡可以促进程序性坏死、抑制自噬。(4)在自身免疫性心肌炎急性期抑制自噬可以促进程序性坏死和凋亡。