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多不饱脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs),尤其是超长链多不饱和脂肪酸(Very long chain polyunsaturated fatty acids, VLC-PUFAs)，具有十分重要的生理功能，是维持人体健康所必需的。通常情况下PUFAs主要来源于深海鱼油和海洋藻类，但是由于过度捕捞，海洋污染以及藻类生产PUFAs价格的昂贵，因此迫切需要寻找一种PUFAs的替代来源。随着转基因技术的迅速发展，利用转基因的油料作物生产PUFAs被认为是一种十分有前景的的替代来源。大豆是最主要的油料作物之一，含有非常丰富的亚油酸(Linoleic acid, LA)和α-亚麻酸(α-Linolenic acid,ALA)，它们分别占大豆中总脂肪酸的55%和13%，是合成花生四烯酸(Arachidonic acid, ARA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)的前体。因此，大豆是通过代谢工程生产ARA和EPA的重要宿主。在转基因植物中，ARA和EPA生物合成的Δ6途径已经被广泛研究了，但Δ8途径仅在拟南芥中进行研究并且不是种子特异性表达。由于在转基因植物中ARA和EPA生物合成的Δ6途径存在复杂的底物转换瓶颈，因此，在本研究中，我们分别在酿酒酵母和大豆中重构ARA和EPA生物合成的Δ8途径，构建出产ARA和EPA的酿酒酵母工程菌和无选择标记基因的转基因大豆；同时对BCSP952启动子进行改造，以便提高转基因大豆中ARA和EPA的合成效率。首先，分别从球等鞭金藻H29(Isochrysis galbana H29)、小眼虫藻FH277(Euglena gracilis FH277)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中克隆出Δ8途径中的三个基因Δ9延长酶基因IgASE2、Δ8脱氢酶基因efd2和Δ5脱氢酶基因ptd5，并在酿酒酵母INVSc1中鉴定它们的功能。IgASE2基因长1653bp，包括一个786bp的ORF (Open reading frame)、一个44bp的5’-UTR(Untranslatedregion)和一个823bp3’-UTR。该基因编码的延长酶IgASE2与已经报道的延长酶IgASE1的氨基酸序列有87%的相似性。IgASE2在酿酒酵母中表达时，能分别将LA和ALA转化成二十碳二烯酸(ω6-eicosadienoic acid, EDA)和二十碳三烯酸(ω3-eicosatrienoic acid, EtrA)，LA和ALA的转化率分别是57.6%和56.1%，表明IgASE2基因是一个新的C18-Δ9专一性的PUFAs延长酶基因。efd2基因ORF长1266bp，编码421个氨基酸，它与已经报道的EFD1的氨基酸序列相似性为96%。efd2基因在酿酒酵母中表达时，催化底物EDA和EtrA转化成二高γ-亚麻酸(dihomo-γ-linolenic acid, DGLA)和二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid, ETA)的转化效率分别约为31.2％和46.3％，表明efd2是一个位置专一性的Δ8脱氢酶基因。ptd5基因ORF长1410bp，编码469个氨基酸。它在酿酒酵母中表达时，催化DGLA和ETA生成ARA和EPA的效率分别约28.7%和37.2%，表明ptd5是一个位置专一性的Δ5脱氢酶基因。然后，利用克隆的IgASE2、efd2和ptd5基因，分别在酿酒酵母和大豆中构建了ARA和EPA生物合成的Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径，获得了产ARA和EPA的酿酒酵母工程菌和无选择标记基因的转基因大豆。根据ARA和EPA生物合成的Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径，将该途径中所需要的三个目的基因IgASE2、efd2和ptd5的表达盒有机集合在一起，构建成酿酒酵母共表达载体pYAE5。将该表达载体pYAE5转化至酿酒酵母INVSc1，构建成酿酒酵母工程菌YAE985。该菌在添加外源底物LA和ALA的诱导培养基中诱导表达后，产生的ARA和EPA分别占总脂肪酸含量的1.6%和2.5%，LA转化成ARA以及ALA转化成EPA的最终转化率分别是10.1%和16.9%。这些结果表明，在酿酒酵母中成功地构建了ARA和EPA生物合成的Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径。利用RT-PCR(Real Time PCR)对工程菌YAE985的遗传稳定性进行了检测，结果表明：工程菌连续转接20次后，IgASE2、efd2和ptd5基因在转录水平仍然保持1：1：1的关系，说明没有发生遗传重组和目的基因部分丢失的情况，因此酿酒酵母工程菌YAE985具有很好的遗传稳定性。用大豆种子特异性启动子BCSP952分别构建基因IgASE2、efd2和ptd5的表达盒，并克隆进表达载体pBX，构建成通过Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径生物合成ARA和EPA的无选择标记转基因大豆的表达载体pX9AE5。用根瘤农杆菌介导的方法进行大豆转化，筛选出含有Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)生物合成途径的转基因大豆。然后对阳性转化植株进行雌二醇诱导，进一步筛选出无选择标记的转基因大豆。转基因大豆种子中ARA和EPA的含量分别占总脂肪酸含量的6.8%和3.6%。这些结果表明，在无选择标记的转基因大豆中成功地构建了ARA和EPA生物合成的Δ8(ω6-Δ8, ω3-Δ8)途径。最后，为了提高转基因大豆中ARA和EPA的合成水平，本文对BCSP952进行了功能分析。在此基础上，对BCSP952进行改造，以提高BCSP952的强度。为了分析BCSP952的功能，分别构建了BCSP952的5-端缺失启动子片段BCSP666、BCSP471、BCSP285和BCSP156。将它们连接到pBI121质粒的GUS基因上游后转化拟南芥并通过GUS组化检测和GUS酶活性测定来鉴定这些启动子的功能。结果表明：BCSP666的活性与BCSP952活性基本相同，达到BCSP952活性的96.5%；BCSP471的活性次之，约为BCSP952活性的69.4%；BCSP285和BCSP156的活性相对较低，仅为BCSP952活性的15.5%和10.1%；除BCSP156片段外，其余5’-端缺失启动子片段都具有种子特异性。说明：种子特异性元件的种类和数量直接影响启动子的强度；并且，在BCSP952启动子的转录起始位点至上游约-594位这个区段内，种子特异性启动子元件的数量越多，启动子的活性越强，但是超过这个区域，增加这些元件的数量，并不能有效增加启动子的强度。为了提高BCSP952的强度，通过在BCSP952启动子的-140位插入ABRE和Sph元件，构建成启动子BCSP952-aa、 BCSP952-as和BCSP952-ss，并将它们转化至拟南芥中进行功能鉴定。GUS组化检测和GUS活性测定表明：GUS基因只在种子中表达，说明改造后的启动子是种子特异性的启动子；BCSP952-as控制的GUS活性最高，约为BCSP952的180%、BCSP952-aa控制的GUS活性次之，约为BCSP952的112%、BCSP952-ss控制的GUS活性反而降低，约为BCSP952的88%。然后，从每种类型的启动子中选择GUS活性最高的4个株系进行southern杂交和RT-PCR分析。Southern杂交表明，含有BCSP952-ss的一个株系的GUS基因是双拷贝，其余启动子的株系中GUS基因都是单拷贝。RT-PCR分析表明：BCSP952-as控制的GUS基因转录水平最高，BCSP952-aa次之，BCSP952-ss最低，这与测定的GUS活性是一致的。这些结果说明：通过对BCSP952进行改造，提高了BCSP952的强度；并且BCSP952的-140位插入一个ABRE和一个Sph元件时的BCSP952-as最强，其强度比BCSP952提高了80%，在BCSP952的-140位插入两个ABRE元件时的BCSP952-aa次之，其强度比BCSP952提高了12%，在BCSP952的-140位插入两个Sph元件时的BCSP952-ss的强度反而降低。