多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是浆细胞的恶性肿瘤，是血液系统中最为常见的恶性肿瘤之一。患者平均生存期仅为3至5年，目前的治疗方法如造血干细胞移植、化疗等都只能延长病人生存时间，无法避免疾病复发和彻底治愈疾病。多发性骨髓瘤的特征性表现为肿瘤性浆细胞的无限增殖和浆细胞生命周期延长，其发生发展主要与其细胞遗传学异常和骨髓微环境的变化有关。成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptors, FGFRs）属于酪氨酸激酶受体家族，该家族有4个成员，分别由不同的基因编码，但蛋白序列之间具有高度的相似性。FGFR3是FGFRs家族的一员，临床研究显示，15%-20%的多发性骨髓瘤患者存在4号染色体和14号染色体(4t;14)(p16.3;q32.3)易位，使得在浆细胞中原本不表达或极微量表达的FGFR3异位高表达。此类病人的预后差、治愈率低，相关研究认为，高表达的FGFR3可通过激活下游MAPK、PI3K和STAT等信号通路影响多发性骨髓瘤细胞的增殖和凋亡，但其具体机制仍不完全清楚。NF-κB是感染和免疫应答过程中一个关键的核转录因子，在淋巴细胞发育，特别是正常B淋巴细胞和浆细胞的发育中发挥重要作用，同时也参与了调控多种类型肿瘤的发生和发展。在哺乳动物中，NF-κB家族包括RelA、RelB、p50/NF-κB1、p52/NF-κB2和c-Rel。在绝大多数情况下，NF-κB通路处于非激活状态，p50和RelA形成的异二聚体在细胞浆中与IκB结合，IκB是经典NF-κB通路的抑制分子，阻止p50和RelA形成异二聚体入核启动下游靶基因的转录。p52的前体蛋白p100与RelB形成异二聚体，当非经典NF-κB通路被激活后，磷酸化IKKα促进前体蛋白p100经由蛋白酶体剪切成为活化形式p52，形成p52和RelB异二聚体，并入核启动下游靶基因的转录。Hideshima等和Jourdan等的研究均表明，阻断NF-κB通路可以有效抑制多发性骨髓瘤细胞系的增殖能力。近年来在临床上广泛应用的化疗药物硼替佐米（Bortezomib）是一种蛋白酶体抑制剂，能够有效阻断NF-κB通路的激活，在多发性骨髓瘤病人的治疗中取得了较好的疗效。NF-κB通路影响多发性骨髓瘤疾病发生和发展，关键原因是其在浆细胞的形成过程中发挥重要作用。首先，NF-κB通路的持续活化可以促进细胞因子的表达，进而促进多发性骨髓瘤细胞的生长。其次，NF-κB通路激活以后，还能调控细胞周期调节因子的表达，使得多发性骨髓瘤细胞逃避细胞周期停滞，发生恶性增殖。NF-κB通路还通过调节抗凋亡因子的表达及促进粘附分子、金属基质蛋白酶的表达、活化等对多发性骨髓瘤的发生和发展进行调控。TRAF3是肿瘤坏死因子受体作用因子(TNF receptor associated factors, TRAFs)家族成员之一，该家族一共有6个成员（TRAF1-TRAF6），主要参与TNF受体家族信号通路。TRAF3蛋白可以与NIK相互作用，该作用触发了NIK蛋白的泛素化-蛋白酶体降解途径。TRAF3蛋白水平降低能够促进NIK蛋白在细胞内的积聚，而NIK能够通过与IKKα发生相互作用，并且直接磷酸化IKKα，使之二聚化，使无活性的NF-κB前体蛋白p100向有活性的p52进行加工，激活非经典的NF-κB通路。本课题组前期研究发现FGFR3与TRAF3存在直接的相互作用，并能通过相互作用降低TRAF3的蛋白水平，使得NIK蛋白发生蓄积，激活非经典的NF-κB通路。相关临床研究表明17%的多发性骨髓瘤病人和40%的多发性骨髓瘤细胞系中均存在NF-κB通路的持续活化，提示这一通路在多发性骨髓瘤的发生发展过程中发挥着十分重要的作用。据此，本实验在多发性骨髓瘤细胞系中探讨异位表达的FGFR3及FGF通路对非经典NF-κB通路的影响，并进一步研究FGFR3及FGF通路在多发性骨髓瘤的发病过程中的作用，为下一步的临床治疗提供可能的治疗靶点。主要研究内容：1. FGFR3和TRAF3相互作用的研究。1.1利用免疫共沉淀技术，在几种细胞系中检测FGFR3与TRAF3的相互作用。1.2在HEK293T细胞中共转染FGFR家族和TRAF3的表达载体，检测不同FGFR与TRAF3的相互作用。1.3利用免疫荧光染色技术，在COS7细胞中检测FGFR3和TRAF3的共定位。1.4利用FGFR3不同结构域的表达载体，确定FGFR3与TRAF3相互作用的具体结构域。2. FGF通路对FGFR3和TRAF3相互作用的影响2.1利用FGFR3不同激活形式的表达载体，检测不同激活形式的FGFR3与TRAF3的相互作用。2.2用FGF2处理细胞激活FGF通路，检测FGF通路对FGFR3和TRAF3相互作用的影响。3. FGFR3对TRAF3蛋白水平的影响3.1在HEK293T细胞中共转染不同FGFR和TRAF3表达载体，检测不同FGFR对TRAF3蛋白水平的影响；相同的方法检测不同激活形式的FGFR3对TRAF3蛋白水平的影响。3.2通过使用蛋白合成抑制剂CHX处理细胞，检测FGFR3对TRAF3蛋白半衰期的影响。3.3利用MG132和氯喹分别阻断蛋白酶体和溶酶体途径的蛋白降解，确定FGFR3降解TRAF3的途径。3.4利用TRAF3和FGFR3的表达载体，检测TRAF3对FGFR3蛋白水平的影响。4. FGF/FGFR3对非经典NF-κB通路关键分子的影响。4.1利用NIK和FGFR3的表达载体，检测FGFR3对NIK蛋白水平的影响。4.2在R3KO-/-小鼠和野生小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）中，检测TRAF3及pERK的蛋白水平的变化。4.3通过使用FGF2和PD173074处理多发性骨髓瘤细胞OPM2，检测非经典NF-κB通路中关键分子TRAF3和NIK的蛋白水平的变化以及p100/p52转化率的变化。5FGFR3-TRAF3-NIK通路对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响5.1利用FGFR3RNAi慢病毒，感染OPM2细胞，检测FGFR3mRNA水平及蛋白水平的变化，以及TRAF3蛋白水平的变化。5.2通过MTT的方法，检测FGFR3基因RNAi后OPM2细胞增殖的变化。主要实验结果：1. FGFR3与TRAF3存在直接相互作用。1.1FGFR3与TRAF3在多种细胞中均有结合。1.2FGFR家族不同受体均与TRAF3存在相互作用。1.3通过免疫荧光染色可观察到FGFR3与TRAF3明显的共定位。1.4FGFR3通过激酶区（Kinase Domain）与TRAF3结合。2. FGF通路的激活促进FGFR3与TRAF3的相互作用。2.1FGFR3-K650M功能增强型突变形式与TRAF3的相互作用较野生型FGFR3与TRAF3的相互作用更强。2.2FGF信号通路激活后，FGFR3与TRAF3的相互作用增强。3. FGFR3通过促进TRAF3泛素化途径的降解来降低TRAF3的蛋白水平。3.1FGFR3降低TRAF3的蛋白水平具有特异性，FGFR1和FGFR2不能降低TRAF3的蛋白水平。3.2FGFR3能够显著缩短TRAF3蛋白半衰期。3.3不同激活形式的FGFR3均能降低TRAF3蛋白水平。3.4FGFR3降低TRAF3蛋白水平是通过促进TRAF3发生泛素化降解。3.5TRAF3对FGFR3蛋白水平没有显著影响。4. FGF/FGFR3对非经典NF-κB通路关键分子的影响4.1FGFR3上调NIK的蛋白水平。4.2在R3KO-/-小鼠的MEF细胞中，TRAF3蛋白水平升高。4.3PD173074处理OPM2细胞后，TRAF3蛋白水平升高，NIK蛋白水平降低，p100/p52转化率降低，非经典NF-κB通路被抑制。4.4FGF2处理OPM2细胞后，NIK蛋白水平增高，非经典NF-κB通路被进一步激活。5. FGFR3-TRAF3-NIK通路促进多发性骨髓瘤细胞的增殖。5.1在FGFR3RNAi的OPM2细胞中，FGFR3mRNA水平及蛋白水平均降低，TRAF3蛋白水平增高。5.2FGFR3RNAi组OPM2细胞增殖较NC组减慢。主要结论：1. FGFR3与TRAF3存在直接相互作用。2. FGFR3降低TRAF3的蛋白水平是通过促进TRAF3泛素化-蛋白酶体途径的降解。3. FGFR3通过激活非经典NF-κB通路促进多发性骨髓瘤细胞的增殖。