动脉粥样硬化(As)是一个多因素参与、多基因异常调控的复杂病理过程,尽管其发病机制尚未完全阐明,但脂质代谢紊乱和炎症是As形成最重要的原因。危险因素造成血管内膜损伤,血液中的单核细胞进入内膜下层,转变为巨噬细胞,摄取大量氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)后形成泡沫细胞和脂质条纹。同时,ox-LDL促进巨噬细胞分泌大量炎症介质,触发血管壁炎症反应,加剧As进展。因此,积极探索调控巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应的机制对于As性心脑血管疾病防治具有重要意义。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)属于整合膜蛋白,其主要功能是介导细胞内的游离胆固醇(FC)和磷脂流出至载脂蛋白A-I(apo A-I),形成新生的高密度脂蛋白(HDL)颗粒,HDL通过胆固醇逆向转运(RCT)途径将过多的胆固醇排出体外,从而维持体内胆固醇的动态平衡。ABCA1基因突变引起丹吉尔病和家族性HDL缺乏症,患者表现为极低的血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,早期出现As,而上调其表达可抑制泡沫细胞形成,促进RCT,减轻As病变。因此,ABCA1已成为As防治的关键靶点。Itaconate(衣康酸盐)是来一种自于三羧酸循环的代谢产物,外源性给予itaconate的衍生物二甲基衣康酸盐(DI)能够缓解小鼠心肌缺血/再灌注损伤。然而,itaconate对巨噬细胞ABCA1表达、RCT及As的影响仍不清楚。蛋白激酶Cα(PKCα)/p38/激活转录因子-2(ATF-2)信号通路与心血管疾病发生发展密切相关。生物信息学分析显示,ABCA1基因启动子区存在ATF-2的结合位点,提示ATF-2可能在促进ABCA1基因转录中发挥重要作用。因此,本研究以PKCα/p38/ATF-2信号通路为切入点探讨itaconate调控巨噬细胞ABCA1表达的机制。焦亡是一种促炎性的程序性细胞死亡方式,分为caspase-1介导的经典途径和caspase-11介导的非经典途径。在经典的焦亡途径中,Nod样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和cleaved caspase-1(C-caspase-1)组装成NLRP3炎性小体,C-caspase-1切割gasdermin D(GSDMD)蛋白、pro-IL-1β、pro-IL-18,使其转变为GSDMD-N、IL-1β、IL-18,GSDMD-N诱导细胞膜穿孔,细胞破裂,IL-1β、IL-18大量释放,诱发炎症反应。细胞焦亡在As发生发展中起重要作用。Itaconate是一种具有抗炎作用的代谢产物,但其对巨噬细胞焦亡的影响尚未阐明。竞争性内源RNA(ceRNA)指非编码RNA(lncRNA)作为分子海绵吸附mi RNA,抑制mi RNA与其靶m RNA的结合,上调mi RNA的靶基因表达,借此实现不同RNA间的相互调控。HOXA11-AS是一种从HOXA11基因的反义链转录产生的lncRNA,生物信息学预测表明,HOXA11-AS序列中存在一个与mi R-223-3p结合的位点,同时NLRP3已经被鉴定为mi R-223-3p的靶基因,提示这3种RNA之间可能存在ceRNA调控模式。然而,itaconate是否通过HOXA11-AS/mi R-223-3p/NLRP3途径影响巨噬细胞焦亡尚待研究。为了明确itaconate与As的关系,我们进行了以下三方面的研究:(1)观察itaconate对巨噬细胞ABCA1表达、胆固醇流出和脂质蓄积的影响,阐明PKCα/p38/ATF-2信号通路在itaconate调控ABCA1表达中的作用;(2)观察itaconate对巨噬细胞焦亡的影响,并探讨HOXA11-AS/mi R-223-3p/NLRP3途径在其中的作用;(3)在体外研究的基础上,以载脂蛋白E敲除(apoE-/-)小鼠为研究对象,整体水平评价itaconate是否通过抑制巨噬细胞脂质蓄积和焦亡发挥抗As作用。本研究初步揭示了itaconate在As发生发展中的作用及分子机制,促进itaconate产生可能是As性心脑血管疾病防治的新策略。第一部分Itaconate通过PKCα/p38/ATF-2信号通路调控巨噬细胞ABCA1表达及脂质蓄积目的:观察itaconate对巨噬细胞ABCA1表达和脂质蓄积的影响,阐明PKCα/p38/ATF-2信号通路在itaconate调控ABCA1表达中的作用。方法:培养THP-1单核细胞,用50 n M的佛波酯(PMA)处理48 h,诱导其分化为巨噬细胞,再用ox-LDL(50μg/ml)孵育相同时间,荷脂后形成泡沫细胞。以不同浓度(0、25、50、100、200μM)的二甲基衣康酸盐(DI,作为itaconate的供体)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24 h,或者予100μM的DI处理细胞不同时间(0、6、12、24、48 h),荧光实时定量PCR(q RT-PCR)和Western blot检测ABCA1表达。接下来,用100μM的DI处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24 h,q RT-PCR和Western blot检测三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1)、B类I型清道夫受体(SR-BI)、肝X受体α(LXRα)表达;液体闪烁计数仪分析胆固醇流出至apo A-I和HDL情况;高效液相色谱法(HPLC)测定细胞内总胆固醇(TC)、胆固醇酯(CE)和FC含量;油红O染色检测细胞内脂质蓄积。生物信息学分析ATF-2与ABCA1启动子结合情况。构建ATF-2过表达质粒(pc DNA3.1-ATF-2),并转染HTP-1巨噬细胞源性泡沫细胞48 h,Western blot检测ATF-2表达。分别构建野生型荧光素酶报告基因质粒(ABCA1-WT)及相应的突变质粒(ABCA1-Mut),与pc DNA3.1-ATF-2(100 n M)或DI(100μM)共转染HEK293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性。DI(100μM)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24 h后,染色质免疫共沉淀(Chip)进一步分析ATF-2与ABCA1启动子结合情况。予100μM的DI孵育THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞0、30、60 min,Western blot检测磷酸化ATF-2(p-ATF-2)、ATF-2、磷酸化p38(p-p38)、p38、磷酸化PKCα(p-PKCα)、PKCα水平。采用50 n M的ATF-2小干扰RNA(si RNA)或scrambled si RNA转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,24 h后通过Western blot检测各组细胞ATF-2蛋白表达。分别用ATF-2 si RNA(50 n M)、p38抑制剂SB203580(10μM)或者PKCα抑制剂Go6976(3μM)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,再用100μM的DI处理,q RT-PCR和Western blot检测ABCA1表达;液体闪烁计数仪分析胆固醇流出情况。结果:DI呈浓度和时间依赖性上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达,但不影响ABCG1、SR-BI和LXRα表达。DI增加ABCA1介导的胆固醇流出,但对ABCG1、SR-BI介导的胆固醇流出无明显影响,同时减少细胞内TC、CE、FC含量,并抑制脂质蓄积。生物信息学预测发现,ABCA1启动子区存在一个ATF-2的结合位点。pc DNA3.1-ATF-2能显著增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ATF-2蛋白水平,表明质粒构建成功。过表达ATF-2或者DI明显增加野生型ABCA1启动子荧光素酶活性,但对突变型荧光素酶活性无影响。Chip实验进一步证实,DI促进ATF-2与ABCA1启动子结合。DI呈时间依赖性增加ATF-2、p38、PKCα磷酸化。此外,ATF-2 si RNA、SB203580或者Go6976预处理逆转了DI对ABCA1表达及胆固醇流出的促进作用。小结:(1)Itaconate上调ABCA1表达,促进胆固醇流出,抑制巨噬细胞内脂质蓄积;(2)Itaconate通过激活PKCα/p38/ATF-2信号通路增加巨噬细胞ABCA1表达。第二部分Itaconate通过HOXA11-AS/mi R-223-3p/NLRP3途径抑制巨噬细胞焦亡目的:观察itaconate对巨噬细胞焦亡及IL-1β、IL-18释放的影响,并阐明HOXA11-AS/mi R-223-3p/NLRP3途径在其中的作用。方法:培养THP-1单核细胞,用50 n M的PMA处理48 h,诱导其分化为巨噬细胞,分为3组:对照组、ox-LDL组和ox-LDL+DI组。对照组、ox-LDL组分别以培养基、50μg/ml ox-LDL处理48 h,ox-LDL+DI组予50μg/ml ox-LDL孵育24 h,再用100μM的DI处理24 h,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定上清液中IL-1β、IL-18水平;q RT-PCR检测NLRP3、caspase-1、GSDMD、mi R-223-3p和HOXA11-AS表达;Western blot检测NLRP3、C-caspase-1和GSDMD-N表达;利用试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平。生物信息学分析mi R-223-3p与NLRP3的3’-非翻译区(3’-UTR)靶向结合情况、种子序列保守性及自由能评分。用40 n M的mi R-223-3p mimic/inhibitor转染THP-1巨噬细胞24 h,q RT-PCR、Western blot检测NLRP3表达。构建野生型荧光素酶报告基因载体(psi-CHECK2-NLRP3-WT 3’-UTR)以及相应的突变载体(psi-CHECK2-NLRP3-Mut3’-UTR),并与mi R-223-3p mimic共转染HEK293T细胞48 h,分析荧光素酶活性。生物信息学分析HOXA11-AS与mi R-223-3p靶向结合情况,并构建HOXA11-AS的野生型荧光素酶报告基因载体(psi-CHECK2-HOXA11-AS-WT)以及相应的突变载体(psi-CHECK2-HOXA11-AS-Mut),与mi R-223-3p mimic共转染HEK293T细胞,48h后测定荧光素酶活性。此外,用pc DNA3.1-HOXA11-AS或mi R-223-3p inhibitor预处理THP-1巨噬细胞,再予ox-LDL、DI孵育,ELISA测定培养液中IL-1β、IL-18水平;q RT-PCR和Western blot检测焦亡相关因子表达,并分析上清液中LDH水平。结果:DI抑制ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-18和LDH分泌,降低NLRP3、C-caspase-1和GSDMD-N水平,但不影响caspase-1、GSDMD m RNA表达。生物信息学分析显示,NLRP3的3’-UTR存在一个mi R-223-3p的结合位点,种子序列在不同物种间具有高度保守性,且结合的自由能较低。mi R-223-3p mimic显著减少THP-1巨噬细胞NLRP3 m RNA与蛋白水平,其inhibitor的作用则相反。mi R-223-3p mimic降低NLRP3-WT 3’-UTR荧光素酶活性,而对NLRP3-Mut 3’-UTR荧光素酶活性无明显影响。生物信息学分析表明,HOXA11-AS序列中也存在一个与mi R-223-3p结合的位点。同时,mi R-223-3p mimic显著减少HOXA11-AS-WT荧光素酶活性,但不影响HOXA11-AS-Mut 3’-UTR荧光素酶活性。DI上调mi R-223-3p表达,下调HOXA11-AS表达。pc DNA3.1-HOXA11-AS或mi R-223-3p inhibitor预处理阻断了DI对巨噬细胞焦亡及IL-1β、IL-18释放的影响。小结:(1)Itaconate抑制巨噬细胞焦亡,减少IL-1β、IL-18分泌;(2)Itaconate通过下调HOXA11-AS表达,上调mi R-223-3p表达,降低NLRP3水平,抑制巨噬细胞焦亡。第三部分Itaconate对apoE-/-小鼠As的影响目的:观察itaconate对apoE-/-小鼠ABCA1表达、血脂水平、RCT效率、细胞焦亡和As斑块面积的影响,从而在整体水平揭示itaconate的抗As作用及分子机制。方法:40只雄性apoE-/-小鼠随机分为对照组(n=20)和DI组(n=20),高脂饮食喂养12 w,DI组腹腔注射DI(4 mg/kg,溶解于0.1 ml生理盐水中),对照组予等体积生理盐水处理,每周两次,每隔2 w称量一次小鼠体重。处死小鼠,分离主动脉弓,体视显微镜观察斑块形成情况。油红O染色观察主动脉壁脂质沉积情况。用HE、油红O和Masson染色分别检测主动脉窦斑块面积、脂质蓄积情况和胶原含量。收集血液,分离血浆,氧化酶法测定TC、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、HDL-C和甘油三酯(TG)水平,ELISA检测IL-1β、IL-18水平。腹腔注射[3H]标记胆固醇的J774细胞,检测血浆、肝脏和粪便中的放射活性,计算RCT效率。提取腹腔巨噬细胞和主动脉,q RT-PCR检测ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα、NLRP3、caspase-1、GSDMD、mi R-223-3p和HOXA11-AS表达;Western blot检测ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα、p-ATF-2、ATF-2、p-p38、p38、p-PKCα、PKCα、NLRP3、C-caspase-1及GSDMD-N表达;液体闪烁计数仪分析腹腔巨噬细胞内胆固醇流出情况。此外,利用免疫荧光染色检测主动脉窦斑块内ABCA1表达水平。结果:DI减少主动脉弓及主动脉窦处斑块面积,抑制主动脉壁及斑块内脂质沉积,增加胶原含量和血浆HDL-C水平,促进RCT,并降低血浆IL-1β、IL-18水平,但对小鼠体重及血浆TC、LDL-C、TG水平无明显影响。DI升高腹腔巨噬细胞和主动脉组织中ABCA1、p-ATF-2、p-p38、p-PKCα水平,但不影响ABCG1、SR-BI、LXRα、ATF-2、p38、PKCα表达。DI下调主动脉组织中NLRP3、C-caspase-1、GSDMD-N及HOXA11-AS表达,上调mi R-223-3p表达,但对caspase-1、GSDMD水平无明显影响。此外,DI增加斑块内ABCA1表达水平,促进腹腔巨噬细胞内胆固醇流出至apo A-I,但不影响胆固醇流出至HDL。小结:(1)Itaconate Itaconate上调ABCA1表达,升高血浆HDL-C水平,促进RCT,减轻apoE-/-小鼠As病变;(2)Itaconate减少细胞焦亡,降低血浆IL-1β、IL-18水平,抑制apoE-/-小鼠炎症反应。结论1.Itaconate激活PKCα/p38/ATF-2信号通路,上调ABCA1表达,促进胆固醇流出,抑制巨噬细胞内脂质蓄积;2.Itaconate通过HOXA11-AS/mi R-223-3p/NLRP3途径抑制巨噬细胞焦亡,减少IL-1β、IL-18分泌;3.Itaconate促进RCT,降低炎症反应,抑制apoE-/-小鼠As进展。