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由于水资源限制和气候变化,干旱一直以来就是制约农业发展的重要环境因素。为了适应干旱,植物进化形成了一系列干旱应答机制。研究植物抗旱机制,提高作物耐旱性,对于干旱和半干旱地区的农业生产发展以及维持国家安定繁荣都具有重大意义。构建干旱胁迫下小麦叶片的cDNA文库,分析干旱胁迫时小麦基因表达情况,为后续挖掘小麦抗旱基因,揭示小麦抗旱机理奠定基础,可为将来进行抗旱小麦育种提供参考,为维护国家粮食安全做出贡献。为了挖掘小麦抗旱基因、揭示小麦抗旱机理。我们利用SMART法构建了小麦叶片全长均一化cDNA文库:首先,对小麦中国春幼苗进行干旱胁迫(20%PEG8000),然后,以胁迫处理的小麦叶片为实验材料,经过RNA提取、cDNA第一链合成、Long Distance PCR、蛋白酶K消化、cDNA均一化、ds cDNA纯化、同源重组等步骤构建小麦叶片的全长均一化cDNA文库;并将文库质粒转入酵母菌株Y187中,得到可直接用于酵母双杂交的cDNA文库工作液;最后,从小麦全长均一化文库中挑取977个单克隆进行5′端测序,经过去低质量序列、去载体序列之后,拼接组装生成unigenes,对unigenes进行BLAST同源比对分析、GO功能注释与分类以及KEGG通路聚类分析等。实验结果如下:1、提取的RNA浓度为2.2860μg/μL,A260/280为2.17,A260/230为2.41,RNA质量高,满足实验要求;2、大肠杆菌文库库容为5.3×105,酵母菌文库库容为1.36×106;文库插入片段平均长度>1000bp。3、通过测序以及序列分析,总共得到804条高质量EST序列,拼接组装得到591个unigenes,其中contigs有64个,singletons有527个;BLAST比对分析表明,579个unigenes在Glycine max、Zea mays、Triticum aestivum、Oryza sativa、Hordeum vulgare、Brachypodium distachyon、Aegilops tauschii、Setaria italica、Sorghum bicolor、Triticum urartu等物种中比对到同源基因,其中以Glycine max、Zea mays、Triticum aestivum等中分布最多。另外,BLAST比对还发现了MYB、bHLH等植物逆境相关的转录因子。GO功能注释与分类结果显示415个unigenes参与多种生物功能,其中28.67%涉及细胞学组件,22.66%涉及分子功能,48.67%个涉及生物学过程。KEGG Pathway聚类分析发现cDNA文库包含了许多植物逆境应答通路。本研究成功构建了高质量的小麦叶片全长均一化cDNA文库,并通过测序分析得到804条高质量EST;对得到的EST序列进行组装、功能注释、分类等分析,发现了一些潜在的与小麦耐旱相关基因。