论文部分内容阅读
目的本研究通过将骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植到血管性痴呆(vascular dememia,VD)大鼠,从行为学、形态学和自由基等不同层面观察BMSCs移植对VD大鼠学习记忆障碍的影响,探讨其作用机制。方法将雄性Wistar大鼠20只随机分为以3组:①假手术组6只②VD模型组6只③BMSCs移植组8只。VD模型组、BMSCs移植组均采用两血管阻断法(2VO)制备VD模型。造模后1周,将标记了荧光素的BMSCs经鼠尾静脉移植到BMSCs移植组大鼠。各组术后4周开始6d的Morris水迷宫行为学测试,记录1～5d每天的平均逃避路程、平均逃避潜伏期、平均逃避速度。第6d测试120s内穿越原平台次数和原平台象限停留时间。水迷宫测试结束后各组大鼠断头取脑,应用HE染色光镜观察各组大鼠海马CA1、CA3、齿状回(dentate gyrus,DG)区细胞形态;应用免疫组织化学方法检测海马CA1、CA3、DG区的突触素(SYN)蛋白表达情况;应用TUNEL法染色观察海马区细胞凋亡情况;应用Western blot检测海马CA1区NMDAR1表达情况;应用透射电镜观察各组大鼠海马CA1区突触形态等超微结构:应用分光光度法检测过氧化氢酶(CAT)、过氧化脂质(MDA)。结果1.造模4w后,经冰冻切片观察到BMSCs移植组大鼠海马区有绿色的荧光物质存在,证明经鼠尾静脉移植BMSCs成功。2.Morris水迷宫测试结果:水迷宫实验1～5d,VD模型组、BMSCs移植组的平均逃避路程和平均逃避潜伏期长于假手术组(p＜0.05),BMSCs移植组的平均逃避路程和平均逃避潜伏期比VD模型组缩短(p＜0.05)。假手术组、BMSCs移植组的平均逃避速度与VD模型组比较差异无统计学意义(p＞0.05)。第6d 120s内穿越原平台位置次数,VD模型组、BMSCs移植组的次数少于假手术组(p＜0.05):BMSCs移植组次数多于VD模型组(p＜0.05)。第6d原平台象限停留时间,VD模型组、BMSCs移植组的停留时间少于假手术组(p＜0.05);BMSCs移植组的停留时间多于VD模型组(p＜0.05)。3.HE染色:VD模型组海马CA1区细胞核染色加深,体积明显缩小,间隙扩大,数量减少,排列疏松,胞核固缩、破裂,细胞界限不清。BMSCs移植组CA1区细胞部小分胞核深染,细胞体积稍微缩小,数量减少,可见间隙,细胞排列保持原有的规则,界限较为清楚,有少量核固缩、破裂,有少量细胞可见核仁。VD模型组CA3区可见少量的细胞胞体缩小,胞核染色略加深;细胞间隙加大,有些细胞发生皱缩,损伤仍明显,细胞排列基本保持原有规则,DG区细胞核染色略加深,细胞间隙加大。DG区细胞数量仍基本正常,细胞排列基本保持原有规则。BMSCs移植组海马细胞CA3区和DG区的细胞中,CA3区有少量胞体缩小、胞核染色略加深,细胞排列基本保持原有规则,DG区少量胞体缩小,细胞数量仍基本正常。4.免疫组化染色结果:VD模型组大鼠海马CA1区、CA3区、DG区SYN蛋白表达低于假手术组大鼠(p＜0.05),BMSCs移植组海马CA1区、CA3区、DG区SYN蛋白表达量高于VD模型组,低于假手术组(p＜0.05)。5.TUNEL染色结果:假手术组海马CA1区可见淡染的细胞轮廓,未见TUNEL染色阳性细胞;VD模型组海马CA1区可见较为集中的凋亡阳性细胞。BMSCs移植组海马CA1区可见极少量凋亡阳性细胞。6.电镜结果:VD模型组突触体积明显减小,形态改变,为长形或不规则形;突触前区变形,突触小泡减少并聚集,线粒体变性,突触前后膜增厚,融合,突触间隙消失,失去其正常形态。BMSCs移植组的突触体积增大,突触小泡增多,部分突触前后膜略见增厚,接近于正常,突触间隙可辨认,仍有线粒体变性。7.Western blot结果:VD模型组海马区CA1区NMDAR1蛋白表达水平明显低于假手术组,BMSCs移植组大鼠海马CA1区NMDAR1蛋白表达水平高于VD模型组,仍于假手术组。8.CAT检测结果:VD模型组的CAT活性明显低于假手术组(p＜0.05),BMSCs移植组CAT活性明显高于VD模型组(p＜0.05),但仍低于假手术组。9.MDA检测结果:VD模型组MDA含量明显高于假手术组(p＜0.05);BMSCs移植组MDA含量低于VD模型组(p＜0.05),但仍高于假手术组。结论1.从行为学、形态学及自由基等不同层面,通过对VD大鼠海马CA1区、CA3区、DG区的SYN表达;CA1区的NMDAR1蛋白的表达情况分析,结果表明SYN、NMDAR1蛋白表达的增高有利于VD大鼠学习记忆能力的恢复。2.BMSCs有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能,分化神经细胞替代受损的神经细胞,并上调表达bFGF、NGF、BDNF、GFAP,增加神经生长因子分泌、抑制细胞凋亡、提高抗氧化能力、刺激内源性神经细胞再生、突触连接的修复建立。BMSCs可以促进突触的的再建、提高突触再建的效能。使大鼠海马突触数量和突触传递功能得以恢复,减少神经元和顶树突丢失,抑制细胞凋亡的过程,改善和恢复VD大鼠的学习和空间记忆能力。