论文部分内容阅读
恶性肿瘤一直是威胁人类健康的头号杀手,肿瘤的治疗目前仍然采用手术和放化疗,放化疗药物导致的不良反应与耐药严重降低了患者的生活质量和生存率。肿瘤的靶向药物是目前的研究热点,细菌靶向治疗肿瘤,是一种新型的治疗策略。减毒沙门菌是一种胞内寄生菌,具有抗肿瘤活性,能携带外源基因运送到肿瘤部位进行肿瘤的靶向治疗。胃癌是消化道常见的肿瘤,在全球恶性肿瘤中排名前列。由于发病比较隐匿,胃癌患者被确诊的时候,一般都是中晚期,错过了最佳的治疗时间,有些患者甚至失去了手术治疗的机会。胃癌细胞浸润与转移是胃癌患者治疗失败与死亡的主要原因。近年来,为改善胃癌患者的预后进行了大量研究,新辅助化疗,放射治疗和分子靶向治疗已成为有效的方法。而胃癌的发病及病理机制较为复杂,控制胃癌复发与转移是治疗胃癌的重要策略。黑色素瘤是危害人类健康的肿瘤之一,其发病率和致死率在肿瘤引起的相关死亡疾病中占比较高。虽然部分患者用药物治疗效果较好,但是仍然有一半以上的患者对药物不敏感。临床使用免疫治疗的药物虽然也可以达到治疗肿瘤的效果,但是价格昂贵,药物敏感率低等缺点。研发价格低廉,特异性强,敏感率高并且使用方便的抗肿瘤药物,成为了当今研究的热点。蜂毒素是蜂毒的主要活性物质,具有抗炎活性,目前主要应用于类风湿关节炎及镇痛消炎方面的治疗,蜂毒素还具有抗肿瘤活性及免疫调节活性。蜂毒素通过上调Th]细胞,释放IFN-y,影响体内CD4+T细胞的分泌,提高机体抗肿瘤能力。课题组前期实验研究发现蜂毒素能够在体内外抑制胃癌和结肠癌的侵袭与转移,并能够诱导肿瘤细胞的凋亡。本研究拟通过体内外实验初步探讨携带蜂毒素基因的重组减毒沙门菌抑制胃癌和黑色素瘤的作用机制,为胃癌和黑色素瘤的治疗提供理论基础。研究内容第一部分重组减毒沙门菌体外抑制胃癌及黑色素瘤细胞的机制研究目的:将携带蜂毒素基因重组减毒沙门菌感染胃癌SGC7901与小鼠黑色素瘤B16F10细胞,探讨携带蜂毒素基因的重组减毒沙门菌对胃癌SGC7901与小鼠黑色素瘤B16F10细胞侵袭、迁移、伤口愈合及凋亡相关分子机制的影响。方法:细胞的迁移、侵袭实验检测重组减毒沙门菌感染胃癌SGC7901与小鼠黑色素瘤B16F10细胞24h后细胞侵袭、迁移及伤口愈合的情况;流式细胞术检测重组减毒沙门菌感染SGC7901和B16F10细胞后诱导细胞凋亡的情况;Western Blot检测重组减毒沙门菌感染 SGC7901 与 B16F10 细胞后,细胞中 PRMT5,P-GSK-3β,Vimentin,Bcl2 与 Bax 蛋白的表达水平。结果:细胞的侵袭和迁移实验结果显示,重组减毒沙门菌与空白对照组、X4550组、GFP组、KLT和5-FU组相比,能够明显抑制胃癌和黑色素瘤细胞的侵袭与迁移;伤口愈合实验结果显示,重组减毒沙门菌组能够明显延缓胃癌和黑色素瘤细胞的愈合速度。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,重组减毒沙门菌组与GFP对照组相比,能够明显的诱导细胞凋亡,对比有统计学差异(P<0.05)。Western Blot结果显示,重组减毒沙门菌组感染SGC7901与 B16F10 细胞 24h 后,PRMT5,P-GSK-3β,Vimentin,Bcl2 的蛋白表达量降低,Bax 蛋白的表达水平升高。结论:携带蜂毒素基因的重组减毒沙门菌能够抑制肿瘤的侵袭、迁移及延缓伤口的愈合;能够诱导细胞凋亡,其机制可能与凋亡相关蛋白Bcl2和Bax有关,通过下调Bcl2促进细胞凋亡,上调Bax来抑制细胞凋亡,及下调PRMT5,P-GSK-3β,Vimentin蛋白水平相关。第二部分重组减毒沙门菌体内抑制肿瘤生长实验研究目的:利用携带蜂毒素基因的重组减毒沙门菌治疗黑色素瘤B16F10小鼠模型,探讨重组减毒沙门菌体内抑制肿瘤生长的机制。方法:购买50只雄性C57BL/6小鼠,适应一周,随机选取其中44只小鼠进行B16F10黑色素瘤造模:在小鼠的背部皮下注射B16F10(1×105细胞/只)细胞,其余的6只为空白对照组。每天检查后背肿瘤部位肿块的大小,确定造模的成功建立。选取36只造模成功的小鼠进行随机分组,分为6组(模型对照组、X4550组、GFP组、MEL组,KLT中药组,5-FU 阳性药物组)。将对应的细菌,调整至1×106CFU/鼠备用,KLT组100μl/鼠,5-FU组0.091mg/g。在成瘤后,第1天开始,X4550组、GFP组、MEL组每周给药一次,KLT组,5-FU组给药3次,每次给药五天,均采用背部皮下注射,实验周期为4周28天。给药第1天开始,每隔5天测量一次小鼠的体重及肿瘤体积的变化并记录,第21天处死小鼠后,剥取肿瘤组织,测量肿瘤质量及肿瘤体积的大小。第3天和21天各取外周血收集上清,流式检测外周血中T细胞,B细胞,巨噬细胞的数量情况,ELISA检测血清中IL-2,IFN-γ,TNF-α,VEGF细胞因子的表达水平;第21天处死小鼠,流式检测脾脏中T细胞,B细胞,巨噬细胞的数量情况。结果:携带蜂毒素基因的重组减毒沙门菌能够明显的抑制小鼠体内肿瘤的生长,与不含蜂毒素的GFP组及中药组、西药对照组相比,有统计学差异(P<0.05);ELISA检测小鼠外周血中IL-2,IFN-γ,TNF-α,VEGF因子的表达水平发现,MEL组中IL-2,IFN-γ,TNF-α因子的表达在第3天与第21天,均呈现表达量升高的情况,而VEGF因子的表达水平在第21天MEL组明显低于GFP对照组,MEL组与GFP对照组对比有统计学差异(P<0.05)。流式检测外周血和脾脏中T细胞,B细胞和巨噬细胞数量的变化发现,外周血和脾脏中CD3+CD4+T细胞与CD3+CD8+T细胞数量明显增加;外周血中B细胞数量在第21天增加,而巨噬细胞的数量在第3天明显增加,在第21天外周血与脾脏中巨噬细胞数目没有明显差异。结论:携带蜂毒素基因的减毒沙门菌,能够有效的抑制小鼠黑色素瘤细胞的生长,不影响小鼠的体重,具有良好的安全性,其机制可能是通过上调IL-2,IFN-y,TNF-α相关因子的表达,并下调VEGF因子的水平;且能够促进肿瘤特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫应答,与B细胞和巨噬细胞共同调节机体的免疫反应,发挥细胞免疫和体液免疫,免疫应答偏向于Th1型。