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目的： 通过添加药物雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）和氯喹（Chloroquine，Chlo）调整肝卵圆细胞的自噬水平，观察肝卵圆细胞的增殖和分化情况改变。 这些： 一、雷帕霉素和氯喹对大鼠肝卵圆细胞自噬水平的调控作用 （1）用分别用40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹处理肝卵圆细胞24小时后,显微镜下观察细胞形态的变化,western blot检测自噬相关蛋白LC3-I和LC3-II以及P62的表达。 二、自噬对肝卵圆细胞在正常环境下的增殖和凋亡的影响 （1）分别用0（空白对照）、5、10、25、50、100、150、200、300、500μmol/L氯喹，以及25、50、100、200、500nmol/L的雷帕霉素分别处理肝卵圆细胞，每个浓度点设置3个时间点24h、48h、72h，应用CCK-8试剂盒检测比较肝卵圆细胞的增殖能力变化。 （2）用分别用40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹处理细胞后，使用流式细胞技术来检测肝卵圆细胞的细胞周期和凋亡细胞比例。 （3）肝卵圆细胞经过40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹处理后，分别提取蛋白通过western blot检测凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（polyADP-ribose polymerase，cleave-PARP）。 三、自噬对正常环境下肝卵圆细胞分化的影响 （1）大鼠肝卵圆细胞培养至对数生长期,利用丁酸钠（Sodium butyrate，SB）诱导分化，通过细胞免疫化学技术观察不同药物处理组体外诱导分化改变情况。 （2）40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹处理实验组与空白对照组分别提取蛋白，通过Western Blot法检测角蛋白19(Cytokeratin19，CK19)蛋白水平 四、探讨自噬调控肝卵圆细胞增殖和分化的可能信号通路 （1）用40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹药物处理组和对照组，分别提取蛋白后通过 Western Blot法检测相关通路NOTCH1胞内区域段(Notch intraCellular domain,NICD)、HES1、HES5蛋白激酶ERK和MAPK(P38)的磷酸化水平。 结果： 1.雷帕霉素能诱导大鼠肝卵圆细胞发生自噬，而氯喹能抑制肝卵圆细胞自噬的发生 （1）雷帕霉素处理后细胞形态变化不明显，而氯喹处理组细胞形态由卵圆形变为三角形，细胞数量减少。 （2）雷帕霉素处理后，引起LC3-II/LC3-I比值增大，P62减少。 （3）氯喹处理组，引起LC3-II/LC3-I比值降低，P62增多。 2.自噬对肝卵圆细胞在正常环境下的增殖和凋亡的影响 （1）氯喹处理后，肝卵圆细胞的增殖对氯喹有时间和剂量依赖性。相同处理时间，随着氯喹浓度的升高，肝卵圆细胞的增殖抑制率逐渐升高；相同处理浓度，随着处理时间的延长，肝卵圆细胞的抑制率逐渐升高。 （2）氯喹处理肝卵圆细胞后，细胞周期SubG1停滞增多，细胞凋亡数量明显增多；而雷帕霉素处理组，细胞周期无显著变化，细胞凋亡数量轻微降低。 （3）雷帕霉素组，引起BCL-2的升高，cleave-PARP降低。 （4）氯喹处理组，引起cleave-PARP的升高，BCL-2降低。 以上结果表示自噬的抑制能抑制肝卵圆细胞增殖的，并且使肝卵圆细胞的周期停滞，促进凋亡。 3.自噬能促进肝卵圆细胞向胆管细胞分化 （1）雷帕霉素处理组，相对于对照组，CK19的荧光量明显增多，两组均高于正常组。 （2）氯喹处理组，相对于对照组，荧光表达量无明显变化。 （3）雷帕霉素处理后相对于正常或者对照组，ck19蛋白的表达量显著提高。 以上结果提示自噬能促进肝卵圆细胞向胆管细胞的分化。 4.肝卵圆细胞的自噬诱导能改变notch通路和MAPK/ERK通路 （1）雷帕霉素能提高MAPK/ERK的磷酸化水平。 （2）雷帕霉素能促进NICD、HES1/HES5的表达。以上结果表示自噬可能通过notch通路和MAPK/ERK通路调控肝卵圆细胞的增殖和分化。 结论 1.自噬的抑制能抑制肝卵圆细胞的增殖，引起周期停滞，促进细胞凋亡。 2.自噬能促进肝卵圆细胞的分化。 3.自噬对肝卵圆细胞的作用可能通过调控notch通路和MAPK/ERK通路。