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目的: 脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤,大约占所有原发性脑肿瘤的45%,这也是癌症患者死亡的主要原因之一。尽管标准治疗方案包括手术完整切除、联合放化疗,但无进展生存期仍然很低,新诊断为胶质母细胞瘤的患者的中位生存期只有12-15个月。新型烷化剂-替莫唑胺(temozolomide,TMZ)已经确定为临床标准的化疗药物,但是在治疗过程中发现部分患者对化疗并不敏感,所以这种现象严重阻碍了恶性胶质瘤患者的预后。限制替莫唑胺的疗效大部分是由于脑胶质瘤细胞内 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA-methyltransferase,MGMT)的活性造成的,它是一种DNA修复酶主要能够特定的移除O6-甲基鸟嘌呤上的甲基团从而逆转替莫唑胺的疗效。近期少数研究证据表明,在恶性胶质瘤类干细胞,垂体腺瘤细胞和U251细胞中发现抑制缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)可以下调MGMT的表达。HIF-1α在肿瘤血管生成、进展、复发和化疗耐药等方面扮演着重要的作用,其中也包括脑胶质瘤。本实验采用体外细胞培养技术,以人源性恶性胶质瘤T98G细胞株为研究对象,观察HIF-1α靶向抑制剂FM19G11是否影响替莫唑胺对恶性胶质瘤T98G细胞株的细胞增殖抑制作用和诱导细胞凋亡作用,同时进一步探索它们之间的分子调控机制。 方法: 以人源性恶性胶质瘤T98G细胞株为研究对象,T98G细胞培养于37℃恒温缺氧培养箱中,气体条件为5%CO2,1%O2,94%N2。设置实验对照组,使用不同浓度的HIF-1α靶向抑制剂FM19G11和替莫唑胺分别单独处理以及二者的联合处理T98G胶质瘤细胞,采用CCK-8法和细胞克隆形成实验分别检测上述不同药物处理后T98G细胞的细胞增殖抑制作用;采用hochest33258染色法和流式细胞技术分别测定在不同处理条件下T98G细胞的凋亡作用;采用qPCR法检测在不同处理条件下T98G细胞内HIF-1α及其下游靶基因的mRNA表达量的差异;采用Western blot法检测在不同处理条件下T98G细胞内HIF-1α及其下游靶基因,以及MGMT和NF-κB信号通路中P65蛋白表达水平的差异;采用细胞免疫荧光技术检测T98G细胞中MGMT和NF-κB信号通路中P65蛋白表达水平的差异。 结果: ⑴MGMT蛋白在各恶性胶质瘤细胞株中呈差异性表达,筛选出MGMT高表达的细胞株。通过Western blot实验结果表明,MGMT蛋白在恶性胶质瘤T98G细胞中呈阳性表达,而在U251,U87MG和U373细胞中MGMT表达均非常低或几乎不表达。故选择恶性胶质瘤T98G细胞株作为接下来的实验研究对象。⑵FM19G11和替莫唑胺各自单独处理以及二者联合处理恶性胶质瘤T98G细胞后,通过CCK-8法和细胞克隆形成实验分别检测显示FM19G11单独处理对T98G细胞无增殖抑制作用,而替莫唑胺对T98G细胞的具有增殖抑制作用,但并不敏感;与替莫唑胺单独处理相比,FM19G11和替莫唑胺的联合处理对恶性胶质瘤T98G细胞具有显著地增殖抑制作用(P<0.05)。⑶通过显微镜下细胞形态学观察与hoechst33258染色法观察发现, FM19G11单独处理并不诱导恶性胶质瘤T98G细胞发生凋亡性形态改变,替莫唑胺单独处理能够使瘤细胞发生凋亡性形态改变,而二者的联合作用对T98G细胞的凋亡形态改变的程度较替莫唑胺单独处理更加明显。⑷通过流式细胞术检测细胞凋亡发现,FM19G11单独处理并不诱导T98G细胞发生凋亡,替莫唑胺单独处理能够诱导T98G细胞发生凋亡作用,而二者的联合处理对T98G细胞的凋亡诱导能力更强(P<0.05)。⑸FM19G11作用后靶向抑制T98G细胞内HIF-1α及其下游靶基因的表达水平。通过qPCR法和Western blot法结果显示,在不同浓度的FM19G11处理下T98G细胞内HIF-1α,VEGF和EPO的mRNA和蛋白表达均显著低于正常对照组(P<0.05),而且具有明显的剂量-效应关系。⑹NF-κB信号通路可能参与FM19G11抑制恶性胶质瘤T98G细胞内MGMT的表达水平。通过Western blot法实验结果发现,在不同浓度FM19G11处理后MGMT和NF-κB P65蛋白表达均明显低于正常对照组(P<0.05),而且具有明显的剂量-效应关系。⑺通过细胞免疫荧光技术检测恶性胶质瘤T98G细胞内MGMT和NF-κB P65的表达水平。实验结果发现在不同浓度FM19G11处理后瘤细胞内MGMT和NF-κB P65蛋白的荧光强度显著低于正常对照组(P<0.05),而且具有明显的剂量-效应关系。这进一步证明NF-κB信号通路可能参与FM19G11抑制恶性胶质瘤T98G细胞内MGMT的表达水平。⑻通过Western blot法检测在FM19G11(2.0μM)和替莫唑胺(500μM)分别单独处理及二者联合处理后,实验结果表明与正常对照组相比,FM19G11单独处理能够显著下降T98G细胞内MGMT蛋白的表达水平(P<0.05),而替莫唑胺能够上调T98G细胞内MGMT蛋白的表达(P<0.05);而FM19G11和替莫唑胺的联合处理能显著降低瘤细胞内MGMT蛋白的表达(P<0.05)。最重要的是,我们观察到FM19G11单独处理不但能明显下调NF-κB信号通路P65亚基的表达水平(P<0.05),在它与替莫唑胺联合作用之后,这种下调作用仍然十分显著(P<0.05)。 结论: FM19G11主要通过靶向抑制HIF-1α的表达,进而下调MGMT蛋白的表达,从而增加恶性胶质瘤T98G细胞对替莫唑胺的药物敏感性,使更多的瘤细胞发生凋亡。此外,我们实验研究发现NF-κB信号通路可能参与FM19G11对MGMT的表达调控。因此,FM19G11和替莫唑胺的联合应用具有显著地协同效应,能够增加恶性胶质瘤细胞T98G细胞的化疗敏感性。总而言之,HIF-1α靶向抑制剂 FM19G11可能成为替莫唑胺的辅助化疗药物,为克服MGMT阳性的恶性胶质瘤提供重要的治疗靶点。