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研究背景肺癌,尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是世界范围内肿瘤患者死亡的最常见原因之一。NSCLC(主要包括腺癌、鳞状细胞癌)占原发性肺癌70%-80%。目前,即使Ⅰ期NSCLC患者实施根治型的外科手术后,复发率仍高达25%-50%,总体生存率欠佳。究其原因,是对肿瘤发生、发展和转移的机制缺乏足够的认识。微小RNA(microRNA,miRNA)是约22个核苷酸长度、单链、非编码蛋白的核苷酸分子,它们构成了一大类广泛存在于植物和动物细胞内的基因调节子,依据与靶序列的互补程度不同通过两种方式负调节靶mRNA的表达。首先,miRNA与编码蛋白的靶mRNA以完全互补或几乎完全互补的方式相结合,从而诱导RNA干扰的发生,mRNA转录产物在miRNA相关、多蛋白的RNA诱导沉寂复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)中由核糖核酸酶断裂,进而降解;这种基因沉默的机制多见于植物细胞中,也见于哺乳动物细胞中。然而,大部分动物miRNAs则是通过另一种不牵涉它们的靶mRNA断裂的机制来发挥作用。这些miRNAs与它们的靶mRNA 3’-UTR区以不完全互补的方式结合,在转录后抑制靶基因的表达。与翻译对照一致,通过这种机制miRNAs降低了蛋白的水平,但该基因的mRNA水平几乎不受影响。生物信息学预测的结果显示每个miRNA可以调控数百个靶基因,这些miRNA几乎对每一条遗传通路都具有潜在的影响,它们调控着不同的生物过程。近来的研究结果证明,miRNA突变和异常表达与各种人体肿瘤发生、发展相关,miRNA可作为癌基因或抑癌基因而起作用。现已证明,miRNA能抑制多种重要肿瘤相关基因的表达。深入研究miRNA在人体肿瘤中的表达状况及其功能,对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义,并将有利于肿瘤的诊断、预后及治疗。Nozomu Yanaihara等研究证实在NSCLC肿瘤组织中miR-155前体表达水平明显高于相邻正常组织,高水平表达的miR-155前体是NSCLC患者预后不良的独立预测指标。miR-155影响NSCLC患者预后的机制目前尚未明了。Yoshida等报道用免疫组化的方法观察到约2/3的NSCLC患者Wee1表达缺失,Wee1表达的减少与患者预后不良及高复发率相关。同时这些Wee1表达缺失的肿瘤细胞增殖能力显著增强。还发现,Wee1蛋白表达水平不是在DNA水平被调控,而可能是通过其它机制被调控。miR-155对Wee1表达的影响尚未见报道。结合文献,我们用生物信息学的方法对miR-155和Wee1 mRNA 3’-UTR的相互作用进行了初步预测,推测Wee1 mRNA为miR-155的靶mRNA, miR-155可能通过影响NSCLC细胞的Wee1表达进而影响患者NSCLC的预后。研究目的观察成熟miR-155在NSCLC的表达,探讨miR-155对A549细胞Wee1 mRNA和蛋白表达的调控及其意义。实验方法1、观察成熟miR-155在肺腺癌、肺鳞癌、A549细胞和H157细胞的表达水平:采用Ambion公司的mirVanaTM miRNA Isolation Kit提取成熟miRNAs,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。采用Ambion公司的mirVanaTM qRT-PCR miRNA Detection Kit、mirVanaTM qRT-PCR Primer Set、SuperTaqTM Thermostable DNA Polymerase和IDT公司合成的标准成熟miR-155模板,进行绝对实时定量RT-PCR,测定肺腺癌、肺鳞癌、相应癌旁正常组织、A549细胞和H157细胞中成熟miR-155的表达水平。2、采用TargetScan、miRanda和PicTar方法预测miR-155与Wee1 mRNA 3’-UTR的互补结合位点,mFOLD法测算互补结合位点5’和3’端70个核苷酸的自由能△G。3、观察miR-155对A549细胞Wee1 mRNA表达水平的影响:采用特异性的miR-155抑制剂AMOs抑制A549细胞内成熟miR-155的活性,以GAPDH mRNA为内参,采用相对实时定量RT-PCR法测定Wee1 mRNA表达水平。4、观察miR-155对A549细胞Wee1蛋白和Phospho-cdc2(Tyr15)蛋白表达水平的影响:采用特异性的miR-155抑制剂AMOs抑制A549细胞内成熟miR-155的活性,以组蛋白H3为内参,采用Western blot测定Wee1蛋白和Phospho-cdc2(Tyr15)蛋白的表达水平。5、观察miR-155对A549细胞和H157细胞增殖的影响:采用不同浓度特异性的miR-155抑制剂AMOs抑制A549细胞和H157细胞内成熟miR-155的活性,分别采用3H-TdR掺入法、MTT法和流式细胞术测定细胞增殖的改变。结果1、经变性聚丙烯凝胶电泳和放射自显影成像,显示成功从组织和细胞中提取高浓度成熟miRNAs。与相应癌旁正常组织相比,肺腺癌组织中成熟miR-155的表达量增加了35.38倍,A549细胞中成熟miR-155的表达量增加了37.95倍。与相应正常组织相比,肺鳞癌组织中成熟miR-155的表达量增加了18.24倍,H157细胞中成熟miR-155的表达量增加了19.42倍。2、采用TargetScan、miRanda和PicTar方法均预测到miR-155与Wee1 mRNA 3’-UTR的有1个互补结合位点,mFOLD法测算互补结合位点5’和3’端70个核苷酸的自由能分别为-9.8kcal/mol和-7.3kcal/mol ,均低于平均随机自由能(△G=-14.01kcal/mol)。3、采用Livak Method,即2△△Ct方法判定Wee1 mRNA表达水平。100nmol/L浓度的AMOs处理的A549细胞中Wee1 mRNA表达量是对照组A549细胞中Wee1 mRNA表达量的1.07倍。以2-△△Ct大于2即相差倍数大于2,为表达量相差显著。100nmol/L浓度的AMOs处理的A549细胞中Wee1 mRNA表达量与对照组A549细胞中Wee1 mRNA表达量相比无显著差异。4、100nmol/L浓度的AMOs处理的A549细胞后,Western blot结果显示:对照组蛋白含量值为9.51±0.29,AMOs组蛋白含量值为29.30±0.18。与对照组相比, AMOs组的Wee1蛋白表达量显著增加(P<0.05);检测AMOs对A549细胞Phospho-cdc2(Tyr15)蛋白表达量的结果显示:对照组蛋白含量值为15.15±0.20,AMOs组蛋白含量值为37.02±0.11。与对照组相比, AMOs组的Phospho-cdc2(Tyr15)蛋白表达量显著增加(P<0.05)。5、采用不同浓度AMOs抑制细胞内成熟miR-155,结果显示:10nmol/L AMOs显着减少A549细胞和H157细胞[3H]-TdR掺入量(P < 0.01),随着AMOs浓度从10nmol/L逐渐增加至100nmol/L , A549细胞和H157细胞[3H]-TdR掺入量依次减少(P<0.01)。MTT分析显示, 10nmol/L miR-155 AMOs显着减少A549细胞和H157细胞数量(P< 0.01),随着AMOs浓度从10nmol/L逐渐增加至100nmol/L, A549细胞和H157细胞数量依次减少(P<0.01) ,抑制率逐渐增加。细胞周期分析显示:100nmol/L AMOs可显着增加A549细胞和H157细胞G0/G1期细胞比例,减少S期和G2/M期细胞比例(P<0.01)。结论1、成功从NSCLC组织和细胞株中提取成熟miRNA,并通过[γ-32P] ATP标记,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。同正常组织相比,肺腺癌、肺鳞癌、A549细胞株和H157细胞株中成熟miR-155的表达水平显著增高。2、生物信息学预测Wee1 mRNA为miR-155的靶mRNA。3、AMOs对Wee1 mRNA的表达水平无显著影响。4、AMOs显著上调了Wee1蛋白和Phospho-cdc2(Tyr15)蛋白的表达水平。5、AMOs能显著抑制A549细胞和H157细胞增殖,这种抑制呈剂量依赖性。