本文对肝素黄杆菌(flavobacteriumheparinum)肝素酶的发酵生产、分离纯化进行了系统研究，并对纯化得到的酶的多种性质进行了测定。 为解决菌种斜面难以保存的问题，研究了糖类对该菌的保护作用。实验中将多种糖类加入菌悬液，观察冷冻、冷藏、冷冻干燥过程中肝素黄杆菌菌体的存活率，并将海藻糖和甘露醇添加进斜面固体培养基，观察菌种的有效保藏时间。结果表明糖类能明显提高肝素黄杆菌在逆境中的存活率，在培养基中添加2％的海藻糖或甘露醇，冷藏下斜面上菌的存活时间可延长两周左右。 研究肝素黄杆菌发酵产肝素酶的工艺，提出了一种将发酵分为生长和产酶两个阶段的生产肝素酶的新工艺。对培养基组成进行了优化，优化后组成(g/L)：葡萄糖10，氯化铵4，磷酸二氢盐5，组氨酸0.75，甲硫氨酸0.75，氯化镁0.5；微量盐10-4mol/L，培养时添加2％碳酸钙。菌体生长和产酶两个阶段的最优温度为27℃和23℃，最佳起始pH为6.4和7.0。在诱导时加入10-4mol/LBa2+可以较好地消除SO2-的阻遏作用。采用优化工艺，摇瓶产酶比原来提高了66％。 以实验菌株为对象，采用优化过的培养基，在摇瓶中能够较好地实现产酶。在利用15L生物反应器进行发酵时，却发现产酶量极低，以至于难以检测到。推断其机理，可能是摇瓶发酵时所添加的碳酸钙对发酵有促进作用。从pH、Ca2+、CO32-、CaCO3物理形态以及试剂杂质离子等角度研究了CaCO3促进肝素黄杆菌产肝素酶的机理。结果显示，CaCO3的作用除调节pH外，其分解产物Ca2+对产酶有促进作用，而CO32-则刺激菌的生长。研究结果还表明，肝素黄杆菌发酵产肝素酶的最佳pH在6.3左右。在研究碳酸钙作用机理的基础上，对发酵罐上的发酵条件进行一定改进，实现了15L发酵罐上的发酵产酶。 在研究肝素黄杆菌发酵产肝素酶时，发现添加核苷对发酵产酶影响很大，单种核苷的添加会严重抑制产酶，而复合核苷的添加则促进产酶，当四种核苷的添加比例与肝素酶mRNA中四种相应核苷酸的比例一致时，促进作用最强。通过HPLC检测，证实添加后核苷很快进入了菌体内。HPLC的结果还表明，菌体内嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的合成代谢可能不平衡。于是又研究了添加天冬氨酸以平衡两类核酸合成代谢以促进产酶的调节方式。 在研究肝素酶分离纯化时，发现在中性的低离子强度的磷酸缓冲液中，肝素酶能分别与DEAE和CM离子柱结合。基于这一现象，提出了一种简便的肝素酶纯化工艺。粗酶液通过羟基磷灰石吸附—解吸处理、DEAE-FF柱层析、CM—纤维素柱层析就可获得电泳纯的肝素酶Ⅰ。其比活为70.18U/mg蛋白，纯化倍数为159.5，酶活回收率13.4％。 在众多的已报道的纯化工艺中，酶活得率均很低，其原因可能在于纯化过程中肝素酶容易失活。为解决这一问题，研究了一些常用的蛋白质活性保护物质对粗肝素酶溶液的保护作用。结果发现，在溶液中10mM的CaCl2具有十分显著的稳定酶活性作用。在此基础上，开发出一种新的肝素酶纯化工艺，在分离纯化的过程中尽量使酶处于一定浓度的CaCl2溶液中，以避免失活。纯化过程如下：粗酶液经硫酸铵沉淀后，先通过一个疏水层析octyl柱，再过CM-纤维素柱、SP650柱、SephadexG-100柱。最后得到电泳纯肝素酶Ⅰ，其比活为90.33U/mg蛋白，纯化倍数为185.1，酶活得率17.8％。 对纯化得到的肝素酶进行了部分性质研究。结果显示，其分子量大约为44kD，等电点为8.5，氮末端不能测定得到，酶的最佳作用条件为45℃、pH6.4-7.0、离子强度150mM，酶在35℃以上极易失活，在pH7-11之间基本稳定。这些结果与已报道的肝素酶Ⅰ的性质相同或相似。其它的性质研究表明，该酶的最大紫外吸收位于280nm，H2O2(1mM，10mM)，NaN3(10mM，100mM)，和乙腈(1％，10％)以及1M的盐酸胍和尿素对酶活无影响，而1％SDS，4M的盐酸胍和尿素使酶完全失活。金属离子试验表明，CaCl2和MgCl2是酶的激活剂，而FeCl2是抑制剂。CaCl2对纯化的肝素酶除了有激活作用，还有很好的活性保护作用。