研究背景蛋白酪氨酸磷酸酶1B（Protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B）是经典蛋白酪氨酸磷酸酶家族（PTPs）的重要成员之一,其突变导致的催化活性或底物特异性异常与许多人类重要疾病密切相关。研究表明:PTP1B可以负向调控胰岛素信号通路、瘦素信号通路,正向调控Ras-Raf-ERK信号通路等体内多种重要的信号通路。因此PTP1B是治疗包括2型糖尿病、肥胖、乳腺癌在内的多种人类重要疾病的潜在药物作用靶点。PTP1B催化活性中心第一层氨基酸在催化过程中发挥了重要的功能,但这些氨基酸在酪氨酸磷酸酶家族成员中高度保守,不利于针对性发展选择特异性抑制剂。而针对PTP1B活性中心的第二层氨基酸而言,其对底物识别、催化也发挥着重要作用,很多疾病相关突变亦发生在这些位置。且活性中心的第二层氨基酸不像第一层氨基酸如此保守,因此从活性中心的第二层氨基酸着手,发展靶点特异性抑制剂更具优势,但目前对于第二层氨基酸的作用机制尚未完全阐明。因此,本课题以蛋白酪氨酸磷酸酶研究的经典酶PTP1B为研究对象,系统研究了 PTP1B活性中心的第二层氨基酸对催化和底物识别的作用,进而为阐明第二层氨基酸突变的致病机理、并为靶向PTP1B活性中心的第二层氨基酸设计小分子抑制剂奠定基础。研究目的本课题以PTP1B为研究对象:（1）系统研究其活性中心第二层氨基酸的分布和保守性;（2）阐明磷酸酶活性中心第二层氨基酸对催化和对底物特异性识别的作用;（3）明确活性中心第二层氨基酸对细胞功能的影响,最终为靶向磷酸酶活性中心第二层氨基酸设计小分子抑制剂奠定基础。研究方法1.研究PTP1B催化活性中心的第二层氨基酸在底物特异性、催化过程中的作用。（1）寻找PTP1B活性中心的第二层氨基酸。通过在Protein Data Base（PDB）中查找PTP1B的已有晶体结构,寻找与PTP1B活性中心保守的第一层氨基酸可能存在相互作用、但并非催化过程中直接与底物相互作用的氨基酸。（2）活性中心的第二层氨基酸突变及基本酶活测定。测定PTP1B野生型和突变蛋白在不同浓度的小分子底物pNPP存在的条件下,其起始反应速率常数,用米氏方程拟合出kcat和Km等酶学常数。利用Biomol Green法,测定PTP1B对生理底物IR peptide、STAT6 peptide的酶学常数。比较野生型与突变蛋白酶活的差异,确定影响催化和底物特异性的活性中心的第二层氨基酸。2.阐述PTP1B活性中心的第二层氨基酸影响催化、底物特异性的结构基础。在大肠杆菌中表达、纯化PTP1B相应突变蛋白,进行蛋白结晶。再利用X射线晶体学方法来确定突变蛋白的三级结构。在WinCoot中通过对比PTP1B野生型和突变蛋白结构区别阐明第二层氨基酸影响催化、底物特异性的结构基础。3.研究PTP1B活性中心的第二层氨基酸对细胞功能的影响。首先在HEK293细胞中过表达STAT6,建立HEK293-STAT6稳转细胞系。随后在STAT6过表达的HEK293细胞中分别过表达PTP1B野生型和突变蛋白。使用白介素-4（IL-4）刺激后,利用Western Blot检测二者对信号转导与转录激活因子STAT6磷酸化水平的影响。研究结果1.PTP1B催化活性中心的第二层氨基酸影响酶的底物特异性及催化效率。（1）基于对PDB中已有的PTP1B晶体结构的分析,我们确定了 22个第二层氨基酸。（2）PTP1B催化活性中心的第二层氨基酸突变后,其对小分子底物pNPP,生理底物IR peptide、STAT6 peptide的酶活均有不同程度的降低。2.PTP1B活性中心的第二层氨基酸突变后,由于氨基酸侧链的改变,原本氨基酸残基侧链基团与第一层氨基酸之间的氢键、疏水作用力等被破坏,进而影响了 PTP1B催化活性中心第一层氨基酸识别、结合底物的能力。3.在HEK293-STAT6稳转细胞系中利用Western Blot检测IL-4刺激细胞后pSTAT6的表达情况,发现PTP1B活性中心的第二层氨基酸突变后,其催化STAT6磷酸化的能力有不同程度的降低。研究结论及意义本课题系统研究了 PTP1B活性中心的第二层氨基酸在PTP1B底物识别和催化过程中的作为,为阐明第二层氨基酸是如何影响磷酸酶底物特异性和催化的奠定基础;进而为阐明第二层氨基酸突变的致病机理,并为靶向PTP1B活性中心的第二层氨基酸设计小分子抑制剂奠定了基础。