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硫酸软骨素（chondroitin sulfate,CS）作为一种代表性的硫酸化糖胺聚糖（glycosaminoglycans,GAGs）,以蛋白聚糖（CSPGs）侧糖链的形式广泛存在于脊椎动物细胞表面或细胞周围基质中,其重复二糖单元结构为:[-4-GlcA-β1-3-GalNAc-β1-]n。CS参与生物体许多生理过程,也与很多病理过程息息相关。临床上,CS类制剂已广泛应用于骨关节炎（osteoarthritis,OA）、软骨损伤和干眼症的治疗,还可以用作抗病毒和抗感染药物;研究表明,CS可以有效的缩短伤口愈合过程或用于中枢神经系统修复;此外,CS单独或与葡糖胺等成分组合作为膳食补充剂已广泛的应用于欧洲和美国的营养保健品中。此外,CS还可用于诊断或治疗恶性肿瘤,许多文献报道肿瘤细胞/组织CS中链长和硫酸化模式的发生改变,因此CS具有作为早期癌症检测生物标记物的潜在应用价值;也有文献报道直接注射酰亚胺修饰的CS到乳腺癌模型裸鼠的肿瘤组织,可有效减慢或清除癌细胞的生长,且不会对邻近的正常组织造成明显的毒性;CS-F还可以在实验性转移小鼠模型中抑制腺癌MC-38细胞的肺定植。人工合成均一度高的多糖或结构均一、确定的寡糖分子已成为CS应用开发的热点问题。目前,规模化销售的CS原料依然是采用传统的动物组织提取法,所获得多糖结构均一性差,易在生产过程中受到杂质污染,甚至可能受到种间病毒和/或朊病毒污染。此外,自鸡、牛或者鱼类软骨提取的CS多糖具有不同的化学结构:重复二糖单位组成不同,且硫酸基团修饰位点及分布也不一致。最终产品糖链长度均一性差硫酸化程度不一致等缺点不但限制了 CS类临床药物的质量的提高使该类药物的安全性受到质疑,同时也很大程度上制约了其作为一种有效的临床药物的进一步开发研究。随着糖工程的迅速发展,糖胺聚糖寡糖的化学酶法发展迅猛,较传统的化学合成法而言,其过程简单、产品收率高并且其反应条件温和,环境友好;此外,随着CS多糖合成机制研究的深入,借助合成生物学手段,通过基因工程菌株发酵生产CS多糖也取得很大的进展。软骨素合酶（chondroitin synthase,ChnS,EC 2.4.1.175）属于 CAZy（Carbohydrate Active enZymesdatabase）GT2 家族,其同时具有 GlcA 和 GalNAc的糖基转移酶（GlcA-T和GalNAc-T）活性,可以交替地将GalNAc和GlcA残基从它们的糖核苷酸转移到CS糖链的非还原末端来催化软骨素链的延伸。作为人工合成CS多糖的关键催化工具分子,该类酶分子的发现、催化模式及底物特异性研究具有重要的理论和应用价值。其中,用于荚膜多糖合成的微生物来源的软骨素合酶与脊椎动物中用于硫酸软骨素合成的同工酶相比,具有易于重组表达,底物选择性宽泛的特点,更有利于人工CS合成。迄今为止已经成功表达并确定的细菌来源软骨素合酶已有三种:来自巴斯德菌F型（Pasteurella type F）的PmCS、来自大肠杆菌K4（E.coli K4）的KfoC和来自绿色硫细菌（Chlorobium phaeobacteroides）的 CpCS。本论文从自 Avibacterium paragallinarum,Actinobacillus Ureae 和 Moraxella canis的基因组中确定了 3种具有GalNAc和GlcA双糖基转移酶功能的新型软骨素合酶,并完成了体外重组表达、催化活性确证,分别命名为ApCS,McCS和AuCS;此外,论文还在上述新型软骨素合酶底物特异性研究的基础上,选择ApCS开展了单糖供体选择机制的初步研究。具体内容包括:（1）通过氨基酸序列比对,发现3种与已知软骨素合酶分子序列相似性在50%左右的编码基因,分别是副鸡禽杆菌（Avibacteriumparagallinarum）的ApCS,尿放线杆菌（Actinobacillus Ureae）的AuCS,犬摩拉克氏菌（Moraxellacanis）的McCS。（2）疑似微生物来源软骨素合酶重组蛋白的可溶性表达与纯化:实现ApCS,AuCS McCS基因在E.coli表达系统中的可溶性重组表达并分别建立了重组蛋白的纯化方法。（3）确定了 ApCS,AuCS及McCS具有软骨素合酶的催化活性:以带有pNP基团的GlcA（GlcA-pNP）为受体,确定了 3种重组蛋白能将GalNAc基团转移到GlcA-pNP的非还原端,生成软骨素结构的二糖GalNAc-GlcA-pNP;以GalNAc-GlcA-pNP为受体,确定了 3种重组蛋白的GlcA转移酶活性。（4）完成了重组ApCS,AuCS及McCS最适反应条件和酶学动力常数的测定。（5）重组ApCS,AuCS及McCS受体底物特异性的分析与机制研究:本实验中首先探究了软骨素合酶可以利用的最短底物糖链长度,结果表明除了PmCS,其他软骨素合酶均可以单糖GlcA-pNP作为受体进行反应,而PmCS所需的受体糖链最短为三糖;通过生物大分子作用仪初步分析了软骨素合酶受体糖链长度差异的机理;此外,以肝素结构-三糖作为底物,测定ApCS的GalNAc-T活性,结果证明肝素结构-三糖为底物时ApCS仍然可以发挥GalNAc-T催化活性。（6）重组ApCS,AuCS及McCS单糖选择性及机制的初步研究:完成了 3种新型软骨素合酶对UDP-GalNAc结构类似的糖核苷酸催化活性的分析,发现McCS表现出最为宽泛的单糖供体选择性;通过蛋白-分子对接模拟并初步分析了 ApCS表现出严格的单糖供体选择性的分子机理——当其底物为UDP-GalNAz时,由于分子中的叠氮基团对蛋白分子的第402位天门冬酰胺形成氢键,使分子偏离Mn2+活性中心,与Mn2+形成的配位作用改变,这可能是该底物不能被催化反应的原因。综上,本论文发现了 3种新型的微生物来源软骨素合酶,使已确定的该类酶分子增加为6种;作为典型的多糖糖链合成酶,论文对软骨素合酶的酶学性质、受体特异性及单糖供体选择性的研究对Leloir家族糖基转移酶的研究具有重要理论意义,而且相关结论直接有利于CS的人工合成体系的发展,应用价值明显。